Что такое лал тест
О методе
ЛАЛ-тест для определения пирогенности лекарственных препаратов является активно развивающимся в настоящее время способом контроля качества лекарственных средств. Он может быть использован и в некоторых других областях, где необходимо быстрое обнаружение грамотрицательных бактерий или их эндотоксинов. В основе этого теста лежит способность лизата амебоцитов (клеток крови) мечехвоста специфически реагировать с эндотоксинами грамотрицательных бактерий (липополисахаридами, ЛПС). В результате реакции эндотоксина и лизата происходит помутнение прозрачной реакционной смеси или образование твердого геля, что и служит индикатором присутствия эндотоксина.
Реакция лизата амебоцитов с эндотоксином была открыта в США в 1964 году, где и был налажен выпуск первых коммерческих препаратов. Поскольку первые исследования были проведены на мечехвостах вида Limulus polyphemus, препарат, полученный из их крови, был назван Лизат амебоцитов Limulus (Limulus amebocyte lysate), сокращенно ЛАЛ-реактив и, соответственно, ЛАЛ-тест.
ЛАЛ-тест считается сегодня наиболее надежным и перспективным способом проверки потенциальной пирогенности лекарственных средств. Преимущества этого теста: высокая чувствительность, простота выполнения, надежность, воспроизводимость, возможность получения количественного ответа. К несомненным преимуществам ЛАЛ-теста относится возможность анализировать в короткий срок большое число образцов. При массовом использовании ЛАЛ-тест, безусловно, дешевле теста на кроликах. Кроме того, этот метод дает возможность проводить постадийный контроль содержания эндотоксинов в процессе производства инъекционных препаратов.
О методе
ЛАЛ-тест для определения пирогенности лекарственных препаратов является активно развивающимся в настоящее время способом контроля качества лекарственных средств. Он может быть использован и в некоторых других областях, где необходимо быстрое обнаружение грамотрицательных бактерий или их эндотоксинов. В основе этого теста лежит способность лизата амебоцитов (клеток крови) мечехвоста специфически реагировать с эндотоксинами грамотрицательных бактерий (липополисахаридами, ЛПС). В результате реакции эндотоксина и лизата происходит помутнение прозрачной реакционной смеси или образование твердого геля, что и служит индикатором присутствия эндотоксина.
Реакция лизата амебоцитов с эндотоксином была открыта в США в 1964 году, где и был налажен выпуск первых коммерческих препаратов. Поскольку первые исследования были проведены на мечехвостах вида Limulus polyphemus, препарат, полученный из их крови, был назван Лизат амебоцитов Limulus (Limulus amebocyte lysate), сокращенно ЛАЛ-реактив и, соответственно, ЛАЛ-тест.
ЛАЛ-тест считается сегодня наиболее надежным и перспективным способом проверки потенциальной пирогенности лекарственных средств. Преимущества этого теста: высокая чувствительность, простота выполнения, надежность, воспроизводимость, возможность получения количественного ответа. К несомненным преимуществам ЛАЛ-теста относится возможность анализировать в короткий срок большое число образцов. При массовом использовании ЛАЛ-тест, безусловно, дешевле теста на кроликах. Кроме того, этот метод дает возможность проводить постадийный контроль содержания эндотоксинов в процессе производства инъекционных препаратов.
Методы обнаружения бактериальных эндотоксинов в фармацевтических препаратах и имплантируемых медицинских изделиях
Бактериальные эндотоксиныявляются ключевым вопросом безопасности и качества в фармацевтической и медицинской промышленности. Важность бактериальных эндотоксинов заключается в том, что они относятся к пирогенам. К пирогенам относятся разнообразные группы соединений, определяемые их способностью вызывать быстрое повышение температуры тела при их введении в кровоток («Pyro» происходит от греческого слова, обозначающего огонь).
Термин бактериальные эндотоксины является практически синонимом липополисахариду (ЛПС/LPS), который является основным компонентом наружного слоя клеточной стенки у грамотрицательных бактерий. Грамотрицательная клеточная стенка более сложна, чем у грамположительных бактерий, и имеет внешнюю мембрану или оболочку, состоящую из ЛПС. Она действует как барьер проницаемости для клетки и также важнадляформирования биопленок и улавливания макромолекул из окружающей среды.
При грамотрицательном бактериальном сепсисе высвобождение пирогенных ЛПС вызывает выделение большого количества воспалительных цитокинов, что может привести к токсическому шоку. Грамотрицательные бактерии постоянно синтезируют ЛПС, чтобы заменить потери с поверхности клетки, и когда клетки умирают, они высвобождают ЛПС из клеточной стенки. Это означает, что свободные ЛПС всегда будут присутствовать в среде, содержащей грамотрицательные виды. Грамположительные бактерии, напротив, не выделяют внеклеточные ЛПС.
Поэтому важно контролировать рост грамотрицательных видов в воде, в других сырьевых материалах и в производственной среде, чтобы предотвратить производство пирогенов. Однако отсутствие грамотрицательных бактерий не означает отсутствия пирогенов. ЛПС является очень стабильным веществом и не разрушается нагреванием или другими средствами. Он может сохраняться очень долго в жидкостях и на сухих поверхностях при отсутствии жизнеспособных бактерий. Это значит, что тесты, специально разработанные для выявления эндотоксина/ЛПС, необходимы для демонстрации безопасности фармацевтических и медицинских изделий.
Метод обнаружения
Первым методом, широко используемым для обнаружения эндотоксина в фармацевтических препаратах, был пирогенныйтест на кролике, первоначально описанный в 1925 году. Этот метод включает в себя инъекции кроликам тестируемой жидкости, а затем наблюдение за ними на предмет любого повышения температуры тела и симптомов лихорадки. Данный метод используется при определении пирогенности, согласно ГОСТ ISO 10993-11-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 11. Исследования общетоксического действия» и ОФС.1.2.4.0005.15 «Пирогенность». Пирогенный тест на кролике является одновременно трудоемким и дорогостоящим для выполнения и не может быть количественным. Его применение также ограничено продуктами, которые не вызывают побочных эффектов у подопытных животных. Этот тест по-прежнему одобрен в качестве метода обнаружения пирогенов, но в настоящее время используется редко, поскольку он был в значительной степени заменен лизатом амебоцитов мечехвоста (Limulus Amebocyte Lysate) или LAL-тестом.
LAL-Тест
LAL-тест берет свое начало в открытии 50-х годов прошлого века, демонстрирующим, что кровь Атлантического мечехвоста (Limulus polyphemus) образует сгустки в присутствии бактериального эндотоксина. Позже было установлено, что эта реакция вызвана фактором свертывания, содержащимся в гранулах подвижных клеток крови, называемых амебоцитами. Фактор свертывания высвобождается в кровь из клеткив качестве защиты от инфекции, когда обнаруживается эндотоксин. Наличие даже очень низких уровней бактериального эндотоксина запускает «коагуляционный каскад» реакций, включающий ряд ферментов сериновой протеазы и приводящий к образованию тромба (сгустка)коагулинового геля. Эта реакция была превращена в чувствительный тест на эндотоксин путем сбора амебоцитов из крови мечехвостов и последующего лизирования клеток с получением реагента, содержащего фактор свертывания – лизатамебоцитов мечехвоста.
Были разработаны три основных LAL-метода: гель-тромб, хромогенный и турбидиметрический. Метод гель-тромб может быть положен в основу очень простого метода детектирования путем добавления реагента к образцу в пробирке и инкубации при 37°C в течение одного часа. Если тромб (сгусток) виден при инверсии трубки, то результат положительный. Это метод конечной точки, и его можно сделать полуколичественным путем тестирования последовательных разведений. Результаты выражаются в единицах эндотоксина (EU), что является мерой эффективности эндотоксина, а не его количества. Это отражает вариабельность токсичности природных ЛПС. Хромогенный метод использует синтетический субстрат, который меняет цвет, когда он расщепляется эндотоксин-активированной протеазой, в то время как турбидиметрический метод опирается на развивающийся сгусток коагулинового геля, изменяющий мутность образца. Оба метода могут быть использованы в качестве количественных кинетических методов путем построения стандартных кривых времени начала воздействия на концентрацию эндотоксина. Спектрофотометрические приборы могут обнаруживать изменения мутности или цвета при гораздо более низких концентрациях эндотоксина, чем те, которые необходимы для образования видимого тромба (сгустка) геля, что делает хромогенные и турбидиметрические методы гораздо более чувствительными, чем метод геля-тромб. Чувствительность определяется самой низкой концентрацией на стандартной кривой.
LAL-тест в настоящее время является стандартным методом тестирования бактериальных эндотоксинов парентеральных лекарственных препаратов и медицинских изделий и определяется как гармонизированный метод в фармакопеях США, Европы, Японии и России (USP chapter 85, EP 2.6.14 Supplement 6.6, JP General Test 4.01, ОФС.1.2.4.0006.15 «Бактериальные эндотоксины»). Можно использовать любой из трех методов, но эталонным методом в случае возникновения каких-либо споров является предельный тест геля-тромб. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) также опубликовало детальное руководство по тестированию бактериальных эндотоксинов и пирогенов для фармацевтической и медицинской промышленности в 2012 году.
Оно включает в себя информацию о планах отбора проб, хранении образцов, валидации альтернативных тестов на бактериальные эндотоксины и предпочтительном использовании количественных тестов в программах качества по дизайну (QBD). При проведении тестирования на бактериальные эндотоксины необходимо учитывать ряд важных моментов. Один из них заключается в том, чтобы обеспечить использование во время тестирования лабораторного оборудования и реагентов без пирогенов для избегания ложноположительных результатов. Медицинские изделия обычно проверяются путем промывки поверхности стандартным объемом специально подготовленной апирогенной воды или подходящим растворителем. Ряд факторов может помешать проведению теста, воздействуя либо на бактериальный эндотоксин, либо на LAL-реагент. Примеры включают рН, концентрацию белка и наличие примесей химических веществ в парентеральных препаратах или в их смывах. Интерференция может привести к неспособности обнаружить бактериальные эндотоксины, и поэтому очень важно его идентифицировать. Лучше всего это сделать с помощью образцов положительного контроля, в которые добавлен подходящий эталонный стандарт бактериального эндотоксина или сертифицированный стандарт.
Существует широкий спектр коммерческих тестовых продуктов, основанных на LAL-методологии, которые ориентированы на удобство и простоту использования. Реактивы для гель-тромб, хромогенных и турбидиметрических испытаний – все они доступны, оптимизированы для конкретного метода и поставляются в лиофилизированной форме с подложками и буферами, готовыми к восстановлению перед использованием. Реагенты выпускаются в количествах, пригодных для одиночных испытаний, для многократных испытаний или навалом для лабораторий, работающих с большим количеством образцов.
Простые тесты на тромб геля могут быть проведены с минимальным оборудованием, в то время как кинетические тесты, по крайней мере, требуют спектрофотометра. Многие коммерческие реагенты теперь предназначены для использования в формате микропланшетов. Степень автоматизации может быть достигнута с помощью считывателей инкубационных пластин, оснащенных программным обеспечением, предназначенным для проведения анализа бактериальных эндотоксинов, таким как Endoscan-V ™ от Charles River.
Экспресс LAL-методы
Альтернативы LAL-тесту
Хотя LAL-тест остается стандартным методом для тестирования бактериальных эндотоксинов, существуют опасения по поводу некоторых аспектов этого метода, которые привели к разработке альтернатив. Например, коммерческие партии лизата могут отличаться по своей чувствительности к бактериальным эндотоксинам, а также по своей специфичности. Но потенциально более серьезной проблемой является сокращение запасов мечехвостов. В то время как кровь этих существ может быть собрана без ущерба для животного, другие экологические нагрузки приводят к тому, что дикая популяция становится под угрозой исчезновения. Отсутствие необходимости собирать их кровь для производства LAL, безусловно, поможет в их сохранении. Многое уже было достигнуто за счет сокращения количества LAL-реагента, необходимого для проведения анализов, но методология все еще опирается на достаточный запас мечехвостов и в конечном счете может оказаться неустойчивой.
Еще одним альтернативным методом является тест на активацию моноцитов (monocyte-activation testing/MAT), который использует иммунную реакцию, обнаруженную в крови человека. Тест использует моноциты, которые активируются пирогенами, чтобы произвести воспалительный цитокин интерлейкин-1β (IL-1β), который затем может быть обнаружен с помощью анализа ELISA. Этот метод не является специфичным для бактериальных эндотоксинов, но также обнаруживает другие пирогены и одобрен EP в качестве альтернативы in vitro теста на пироген кролика. Это говорит, что он является лучшим индикатором реакции лихорадки человека на пирогены, чем LAL-тест, потому что он основан на иммунном ответе человека. MAT-тест был реализован в коммерческих продуктах, таких как система Pyro Detect, поставляемая компанией Merck Millipore.
Метод Hbt LAL это чувствительный и специфичный набор для определения и измерения бактериального эндотоксина, вызывающего лихорадку продукта грам-отрицательных бактерий, известного как пироген. Тест основан на том факте, что эндотоксин вызывает мутность и загущение LAL (Лизат амебоцитов Limulus), этот процесс основан на энзиматической реакции. Простота и экономичность LAL теста способствует его применению для анализа различных биологических жидкостей (включая сыворотки), устройств, (воздушных)фильтров и культуральных сред.
Назначение
Метод Hbt LAL предназначен для количественного измерения эндотоксина в культуральной среде, плазме, сыворотке и других растворах. Предел чувствительность метода составляет 1.4 пг/мл и диапазон измеряемых концентраций от 1 до 1,000 пг/мл.
Принцип метода
Frederick Bang наблюдал, что бактерии вызывают внутрисосудистую коагуляцию у американского мечехвоста, Limulus polyphemus. В сотрудничестве Levin и Bang обнаружили, что агент, ответственный за свертывание постоянно присутствует в амебоцитах мечехвоста, или циркулирующих клетках крови, и что пироген (бактериальный эндотоксин) энзиматически вызывает помутнение и гелеобразование.
Настоящий метод использует активацию энзима. В присутствии бесцветного субстрата, Энзиматическая реакция будет вызывать развитие желтого окрашивания по мере расщепления хромофора, p-нитроанилина (pNA). Реакция останавливается добавлением уксусной кислоты и абсорбция при длине волны 405 нм измеряется с помощью спектрофотометра. Концентрация эндотоксина в образце с неизвестной концентрацией, который тестируется одновременно со стандартами, может быть определена из калибровочной кривой.
Pyrogenicity
ЛАЛ-тест для определения пирогенности лекарственных препаратов является активно развивающимся в настоящее время способом контроля качества лекарственных средств. Он может быть использован и в некоторых других областях, где необходимо быстрое обнаружение грамотрицательных бактерий или их эндотоксинов. В основе этого теста лежит способность лизата амебоцитов (клеток крови) мечехвоста специфически реагировать с эндотоксинами грамотрицательных бактерий (липополисахаридами, ЛПС). В результате реакции эндотоксина и лизата происходит помутнение прозрачной реакционной смеси или образование твердого геля, что и служит индикатором присутствия эндотоксина.
Реакция лизата амебоцитов с эндотоксином была открыта в США в 1964 году, где и был налажен выпуск первых коммерческих препаратов. Поскольку первые исследования были проведены на мечехвостах вида Limulus polyphemus, препарат, полученный из их крови, был назван Лизат амебоцитов Limulus (Limulus amebocyte lysate), сокращенно ЛАЛ-реактив и, соответственно, ЛАЛ-тест.
ЛАЛ-тест считается сегодня наиболее надежным и перспективным способом проверки потенциальной пирогенности лекарственных средств. Преимущества этого теста: высокая чувствительность, простота выполнения, надежность, воспроизводимость, возможность получения количественного ответа. К несомненным преимуществам ЛАЛ-теста относится возможность анализировать в короткий срок большое число образцов. При массовом использовании ЛАЛ-тест, безусловно, дешевле теста на кроликах. Кроме того, этот метод дает возможность проводить постадийный контроль содержания эндотоксинов в процессе производства инъекционных препаратов.
Пирогены и эндотоксины
Термин «пироген» происходит от греческого “pyreto” – лихорадка. Пирогенами называют вещества, способные вызывать повышение температуры тела. Пирогенную реакцию способны вызывать вещества самой различной природы и разного происхождения. К пирогенам можно отнести грамотрицательные бактерии и их токсины, грамположительные бактерии и их токсины, вирусы и продукты их жизнедеятельности, а также стероиды и пр. В области контроля качества инъекционных лекарственных средств практическое значение имеют бактериальные эндотоксины, которые являются фрагментами внешней стенки грамотрицательных бактерий.
Грамотрицательные бактерии обладают двуслойной клеточной стенкой, которая окружает цитоплазматическую мембрану. Первый слой — очень тонкая (толщиной 1 нм) нелипидная мембрана, состоящая из пептидогликана. Его называют также гликопептидом или мукопептидом. Это сложный матрикс, содержащий полисахаридные цепи, связанные друг с другом поперечными сшивками из коротких пептидных цепей. Второй слой клеточной стенки — липидная мембрана толщиной 7,5 нм. Именно на этой внешней мембране и расположены эндотоксины (липополисахариды). Молекулы эндотоксина обеспечивают структурную целостность, отвечают за многие физиологические функции, в том числе определяют патогенные и антигенные свойства бактерий. Структурно молекула эндотоксина делится на три части – Липид А, Кор и О-специфическую цепь.
Липид А состоит из дисахарида, фосфата и жирных кислот. Жирные кислоты, входящие в состав Липида А, могут быть насыщенными и ненасыщенными. Наиболее часто в состав Липида А входят кислоты: пальмитиновая, лауриновая, глутаминовая, меристиновая. Участок Липида А является наиболее константным участком молекулы ЛПС, и его строение схоже у многих бактерий.
О-специфическая цепь липополисахаридов построена из повторяющихся олигосахаридов. Наиболее распространенными сахарами, входящими в состав О-специфической цепи, являются глюкоза, галактоза, рамноза. Этот участок молекулы придает ей гидрофильные свойства, благодаря которым ЛПС хорошо растворимы в воде. Полисахаридная часть является наиболее вариабельной частью молекулы ЛПC. Часто этот фрагмент молекулы называют О-антигеном, так как именно он отвечает за антигенную активность грамотрицательных бактерий.
Кор — центральная часть молекулы, связывающая О-антиген с Липидом А. Формально структура кора подразделяется на внешнюю и внутреннюю части. В состав внутренней части кора обычно входят остатки L-глицеро-О-манногептозы и 2-кето-3-дезоксиоктоновой кислоты (КДО). КДО содержит 8 атомов углерода и в природе практически нигде больше не встречается.
Кроме липополисахаридов в состав внешней стенки грамотрицательных бактерий входят и белки (внешняя мембрана на ¾ состоит из ЛПС, и только ¼ приходится на белковые компоненты). Эти белки вместе с ЛПС образуют белково-липополисахаридные комплексы разного размера и молекулярной массы. Именно эти комплексы и называютсябактериальными эндотоксинами. Очищенные препараты, которые используются в качестве стандартов, лишены пептидных фрагментов и представляют собой чистый препарат липополисахарида. Тем не менее, термин «бактериальные эндотоксины» применяется с равным успехом и к естественным эндотоксинам, оказавшимся в растворе в результате разрушения бактерий, и к чистым препаратам ЛПС.
На внешней стенке одной грамотрицательной бактерии может содержаться до 3,5 млн. молекул ЛПС. После ее гибели все они оказываются в растворе. Эндотоксины грамотрицательных бактерий остаются биологически активными молекулами и после гибели бактерий. Молекула эндотоксина температуростабильна и легко выдерживает цикл стерилизации в автоклаве. Малые размеры молекул эндотоксинов позволяют им легко проходить через мембраны, используемые для стерилизации растворов (0,22 мкм). Поэтому эндотоксины могут присутствовать в готовых лекарственных формах, даже произведенных в асептических условиях и прошедших финишную стерилизацию.
Бактериальные эндотоксины являются исключительно активными (сильными) пирогенами. Для развития лихорадочного приступа достаточно присутствия бактериальных эндотоксинов в инфузионном растворе в концентрации 1 нг/мл (около 10 ЕЭ/мл). Другие пирогены менее активны, и для развития пирогенного ответа их концентрация должна быть в 100-1000 раз больше. Обычно термины «пирогены» и «эндотоксины» употребляются как синонимы и, хотя не все пирогены являются эндотоксинами, наиболее значимыми являются именно эндотоксины грамотрицательных бактерий.
Природа реакции
По современным представлениям в лизате амебоцитов находятся, как минимум, три фермента и белок-субстрат. Ферменты находятся в форме предшественников, первый из них, Фактор С, способен специфически связываться с эндотоксинами. Он переходит в активную форму: активный Фактор С. Активный Фактор С переводит в активную форму следующий фермент: Фактор В. Последний в ряду ферментов, профермент, и его активная форма: свертывающий фермент. Свертывающий фермент перерабатывает субстрат: коагулоген. Молекула коагулогена разрезается на несколько полипептидных цепей, между которыми затем образуются связи, в результате чего получается пространственная структура геля.
Ферменты, составляющие систему свертывания мечехвостов, являются сериновыми протеазами, очень похожими на факторы свертывания крови у млекопитающих. То же самое можно сказать и о субстрате, не случайно название коагулоген сходно с названием белка субстрата в системе коагуляции млекопитающих: фибриногеном.
Для активации ферментной системы, точнее первого фермента в каскаде, Фактора С, нужны минимальные концентрации бактериальных эндотоксинов.
В основе всех методов оценки концентрации эндотоксинов лежит измерение степени активации ферментной системы, хотя способы измерения её активности могут быть различными. Концентрация эндотоксина может быть определена путем оценки количества переработанного субстрата (естественного или искусственного) за определенный промежуток времени: анализы по конечной точке. Она также может быть определена путем оценки времени, необходимого для переработки определенного количества субстрата (точнее по определению скорости этой переработки): кинетические анализы.
В естественной ситуации свертывающий фермент разрезает коагулоген на несколько фрагментов, которые затем полимеризуются. В результате реакции с прозрачной реакционной смесью происходят изменения, которые выражаются в помутнении содержимого, образовании вязких гелевых масс и, в конце концов, в образовании твердого геля. Гель, образующийся в результате реакции, удерживается в виде плотного опалесцентного сгустка на дне пробирки при ее переворачивании на 180°. Такой наиболее простой способ оценки активности ферментной системы называется гель-тромб тест.
Процессу образования геля предшествует процесс полимеризации субъединиц коагулина, который сопровождается помутнением реакционной смеси. Степень этого помутнения может быть измерена фотометрически. Чем выше концентрация эндотоксина, тем активнее ферментная система, тем меньше надо времени для переработки субстрата, тем быстрее идет реакция. Метод, в котором результат реакции определяется по степени этого помутнения, называется турбидиметрическим тестом.
Пожалуй, наиболее интересным способом измерения активности ферментной системы является хромогенный тест. Для проведения этого анализа используется специальный ЛАЛ-реактив, в котором коагулоген заменен на искусственный хромогенный субстрат. Хромогенный субстрат представляет собой простой полипептид с хромофором на конце. Последовательность аминокислотных остатков в полипептиде аналогична аминокислотной последовательности коагулогена, предшествующей связи, разрезаемой свертывающим ферментом. Активный свертывающий фермент отрезает хромофор от пептидной цепи, и в растворе развивается желтое окрашивание. Интенсивность окраски пропорциональна активности свертывающего фермента, которая в свою очередь определяется количеством эндотоксина в растворе. Интенсивность окраски также измеряется фотометрически.
Кинетические методы позволяют проводить точное количественное определение концентрации эндотоксина в растворе. Они позволяют во многом стандартизировать и автоматизировать процесс проведения реакции. Важным считается и тот факт, что автоматическая обработка и хранение результатов снижают риск получения ошибки, связанной с человеческим фактором.