Буккальный эпителий для чего
ВС РФ: взятие буккального эпителия для генетических исследований уже само по себе требует наличия медлицензии по генетике
 |
| dusanpetkovic / Depositphotos.com |
Штраф в 40 000 рублей заплатил медцентр, который, – сам не имея лицензии на осуществление первичной специализированной медико-санитарной помощи в амбулаторных условиях по генетике – отбирал у пациентов образцы буккального эпителия и направлял их в генетическую лабораторию (третье лицо, у которого имеется соответствующая лицензия). Наказание было наложено судом по ч. 2 ст. 14.1 КоАП (Осуществление предпринимательской деятельности без лицензии) (Определение Верховного Суда РФ от 11 декабря 2019 г. № 308-ЭС19-22433 «Об отказе в передаче жалобы в Судебную коллегию Верховного Суда Российской Федерации»).
Медицинский центр был с этим категорически не согласен:
Однако, вышестоящие инстанции тоже нашли в деятельности центра состав правонарушения:
Верховный Суд РФ полностью согласился с этим, заодно не согласившись с медцентром в вопросе исчисления срока давности привлечения к ответственности.
Дело в том, что Росздравнадзор составил протокол по ч. 2 ст.14.1 КоАП РФ в начале ноября, без проведения проверки, на основе жалобы от пациентки. Однако пациентка жаловалась на забор буккального эпителия еще летом. А это значит, что на момент наложения штрафа трехмесячный срок давности привлечения истек, – по мнению оштрафованного медцентра.
На это ВС РФ отметил, что – исходя из установленных обстоятельств, – на момент составления протокола, то есть в начале ноября, медцентр продолжал собирать буккальный эпителий, то есть осуществлять подлежащую лицензированию деятельность. А значит, и срок давности нужно исчислять от дня составления протокола, а не от дня забора спорных образцов эпителия.
Использование буккального эпителия в исследованиях.
ОТЧЕТ
«Основы биологического эксперимента»
Выполнил:
Студент МБФ группы № 4501
Принял:
Глава 1. Индивидуальные особенности чувствительности аппарата буккального эпителия человека к действию электромагнитного излучения сотового телефона
2. Материал и методы 8
2.1.Приготовление препарата 8
2.5. Дифференцировка клеток 12
2.6. Статистический анализ методом Манна-Уитни 12
2.7.Собственные данные 13
Глава 2.Спектральный анализ выдыхаемого воздуха человека.
Список источников 17
Глава 1. Индивидуальные особенности чувствительности аппарата буккального эпителия человека к действию электромагнитного излучения сотового телефона
Введение.
NOKIA LUMIA 530 — смартфон, работающий на платформе Windows Phone с 4х-ядерным процессором Qualcomm Snapdragon 200 MSM8210 1200Mhz, оснащенный TFT-дисплеем, отображающим до 16 млн. цветов. Оснащен аккумулятором на 1430 mAh, который позволяет аппарату работать до 528 часов в режиме ожидания и до 13.4 в режиме разговора.[1](Приложение 1)
Клетка является структурно-функциональной единицей организма. Патологические и физиологические процессы, происходящие в организме, связаны с изменениями структуры и функции клеток. Каждый патологический процесс (заболевание) представляет собой длинную цепь причинно-следственных отложений. Пусковым звеном в этой цепи является повреждение (альтерация).
Характер повреждения зависит от: природы патогенного фактора, индивидуальных видов свойств живого организма. Патогенный агент может вызвать повреждение на различных уровнях: молекулярном, клеточном, органном, тканевом, организменном. Одновременно с повреждением включаются защитно-компенсаторные процессы на тех же уровнях.
Патология клетки представлена 3-мя основными разделами:
1)Патология клетки в целом (нарушение метаболизма, дистрофия, некроз, гипертрофия, атрофия).
2)Патология субклеточных структур и компонентов (лизосомные, хромосомные болезни, болезни «рецепторов», пероксисомные болезни).
3)Нарушение межклеточных взаимодействий и кооперации клеток.
Повреждение клетки – это морфо-функциональные, метаболические, физико-химические изменения, ведущие к нарушению жизнедеятельности клетки. Альтерация клетки выражается дистрофией, атрофией, некрозом.
Классификация факторов повреждения.
1)Физические (механические, температурные, лучевые)
2)Химические (ядовитые вещества, кислоты, щелочи, лекарства)
3)Биологические (вирусы, бактерии)
4)Психогенные (повреждения нейронов мозга и их ансамблей у человека)
II. По происхождению:
Патология клеточного ядра может быть представлена следующими изменениями:
1)Изменение структуры ядра
2)Изменение размеров ядра
3)Изменение формы ядра
4)Изменение количества ядер и ядрышек
5)Появление ядерных включений.[2]
В данной практической работе мы рассмотрим влияние такого эктогенного физического фактора, влияющего на структуру клетки, как электромагнитное излучение сотового телефона.
Действие излучения на клетки.
В клетке нет таких структур, которые не поражались бы при облучении. По современным представлениям, гибель клеток вызывается в первую очередь поражением ядерных структур. В пораженных клетках выявляются физико-химические изменения: повышение проницаемости клеточных оболочек, изменение вязкости и гидрофильности цитоплазмы и др.
Происходят и морфологически определяемые сдвиги: слипание, набухание, разрыв с последующей утратой части хромосом или неправильным воссоединением концов (хромосомные аберрации), изменения микросом и лизосом, увеличение ядра и изменение его формы, изменение формы и размеров клеток, вакуолизация цитоплазмы.[3]
Использование буккального эпителия в исследованиях.
Являясь частью мукозальной системы, буккальный эпителий сохраняет элементы ее активной позиции во взаимоотношениях со стимулами, исходящими из внешней и внутренней среды. Это позволяет использовать его для изучения физиологии и реактивности слизистых оболочек, в том числе в качестве индикатора местных и общих нарушений гомеостаза.
Обладая чувствительностью к различным экзогенным и эндогенным воздействиям, буккальные эпителиоциты подвергаются функциональным изменениям при различных нарушениях локального и системного гомеостаза. Об этом можно судить по ряду морфофункциональных, физико-химических и биохимических показателей. Функциональная перестройка буккальных эпителиоцитов проявляется и в изменении их взаимоотношений с резидентной и факультативной микрофлорой[4]
Буккальный эпителий для чего
В настоящее время люди ищут более простые и информативные методы диагностики изменения гомеостаза человека. Одним из современных методов диагностики является исследование клеток буккального эпителия полости рта. Этот объект является одним из не инвазивных тестов, отражающих общее состояние человека. Отклонение биохимических, физико-химических и морфофункциональных показателей, возникающие под воздействием различных экзогенных и эндогенных факторов, приводят к изменениям дифференцировки эпителия, регистрируемым морфологически (размер, характер ядер и гранул, признаки цитолиза), а также изменению заряда на поверхности ядра живой клетки.
Цель исследования – провести сравнительную характеристику методов определения состояния эпителиальных клеток слизистой оболочки полости рта.
Цитологический метод. Со слизистой оболочки щеки стерильным шпателем соскабливают эпителиальные клетки, которые аккуратно наносят на предметное стекло. Мазок фиксируют метанолом в течение 1 суток. Далее проводят предварительный гидролиз соляной кислотой (37 °С, 30мин) и окрашивают по Фёльгену. На каждом стекле подсчитывают некоторое количество клеток. В образцах буккального эпителия определяют частоту встречаемости клеток с аномалиями ядра [1]. Микроядра идентифицируют как округлые хроматиновые тела с непрерывным гладким краем, лежащие в цитоплазме отдельно от ядра в одной плоскости с ним и имеющие тот же рисунок хроматина и окраску той же интенсивности. Параллельно учитывают клетки с другими ядерными аномалиями: кариопикноз – плотное гомогенное ядро, размером до 6 мкм; кариорексис – распад ядра на отдельные части с гомогенной структурой; двуядерные клетки идентифицируют, если рисунок цитоплазмы не указывает на наложение двух клеток и отсутствует наложение ядер; амитоз – клетки с двумя тесно примыкающими друг к другу ядерными структурами, примерно равными по размеру, разделенными достаточно глубокой бороздой, но на небольшом протяжении сливающимися; феномен «разбитого яйца» – ядро, связанное с основным ядром ахроматиновым мостиком; клетки с лизисом ядерной мембраны – клетки с негладким прерывистым краем ядер [7]. По наличию той или иной ядерной аномалии можно судить о механизме воздействия патогенного фактора на клетку.
Метод внутриклеточного микроэлектрофореза. Сущность метода состоит в том, что у здорового человека ядра клеток буккального эпителия в электрическом поле смещаются к аноду, т. е. они электроотрицательны. У клеток с патологией изменяется заряд мембраны, следовательно, такие клетки меняют свое «нормальное» направление в электрическом поле. Установка для микроэлектрофореза состоит из стабилизатора, камеры для микроэлектрофореза и микроскопа. Камера представляет собой предметное стекло с платиновыми электродами, находящимися на расстоянии 2 см друг от друга. Стабилизатор предназначен для преобразования напряжения электросети в постоянную величину напряжения 50 В и подачи его на камеру микроэлектрофореза. Напряженность в камере при этом составляет 2500 В/м, а величина тока 0,1—0,2 мА. Нарушение электрокинетических свойств ядер буккального эпителия в форме значительного уменьшения количества подвижных ядер говорит о наличии патологии. Такое явление наблюдается у больных алкоголизмом и гипертонической болезнью.
При дополнительной оценке скорости пробега ядер буккального эпителия с помощью окуляр-микрометра возможно составить интегральную кривую. При анализе данной кривой возможно проследить зависимость процента электроподвижных ядер от возраста и определить биологический возраст испытуемого [6].
Метод определения конденсации хроматина. При окрашивании ядра клетки орсеином в нем можно четко определить количество гранул гетерохроматина. Этот показатель характеризует морфологический параметр клеточного ядра, связанный с его функциональным состоянием. Для определения изменения степени конденсации хроматина в интерфазных ядрах клеток буккального эпителия клетки окрашивают в 2% растворе орсеина в 45% уксусной кислоте, в течение 30 мин, затем рассматривают при увеличении х600. Определяют среднее количество гранул гетерохроматина на одно ядро, потом подсчитывают среднюю величину содержания гранул гетерохроматина для некоторого количества ядер и величину статистической ошибки. Повышение показателя содержания гранул гетерохроматина свидетельствует о возрастании степени конденсации хроматина.
Как правило, явление конденсации хроматина связано с понижением активности биосинтетических процессов в ядре [10]. Эта реакция является также неспецифическим клеточным ответом на действие повреждающих факторов [11]. Также известно, что содержание стрессовых гормонов в крови возрастает в ответ на физическую нагрузку [9]. Было установлено, что гормоны стресса вызывают увеличение содержания гранул гетерохроматина в концентрациях, близких к физиологическим [8], поэтому в случае утомления, вызванного физическими нагрузками конденсация хроматина может быть связана с воздействием гормонов стресса [5].
Метод лазерной корреляционной спектрометрии (ЛКС). Для измерения размеров наночастиц используется метод динамического рассеяния света (ДРС). Данный метод позволяет определить коэффициент диффузии дисперсных частиц в жидкости путем анализа корреляционной функции флуктуаций интенсивности рассеянного света. Далее, из коэффициента диффузии рассчитывается радиус наночастиц. Метод ЛКС позволяет определять дисперсный состав исследуемой жидкости по относительному вкладу содержащихся в ней частиц в рассеяние света. Распределение частиц по размерам, в результате математической обработки, позволяет охарактеризовать дисперсный состав конкретной биологической жидкости и классифицировать распределения в соответствии с выделенными информативными зонами спектра.
Для рото-глоточных смывов принято выделять следующие информативные зоны – низкомолекулярную (0-50 нм), среднемолекулярную (51-400 нм), высокомолекулярную (401-2000 нм) и сверхвысокомолекулярную (выше 2000 нм). Предполагается, что нарастание площадей низко- и среднемолекулярных мод ЛК-спектров свидетельствует о преобладании процессов биосубстратной деградации, а высоко- и сверхвысокомолекулярных мод – о преобладании процессов биосубстратной полимеризации. На этих принципах создан классификатор, позволяющий по характеру распределения частиц выделить три типа спектров: «норма», спектры с преобладание катаболических процессов и спектры с преобладанием анаболических процессов [1]. Так у клеток с кариорексисом или кариолизисом преобладает катаболический тип ЛК-спектра. Это происходит из-за выхода из клеток разрушенного ядерного материала, что приводит к увеличению вклада в светорассеяние низкомолекулярной субфракции, которое характерно для катаболических процессов.
Заключение. Таким образом, среди рассмотренных методов нет ни одного, который подходил бы для диагностики всех заболеваний. Отдельно взятый метод имеет свои достоинства и недостатки. Так, например, цитологический метод прост в использовании, не требует специализированного оборудования и высокой квалификации микроскописта. Появление микроядер в клетках буккального эпителия служит хорошим индикатором воздействия ксенобиотиков или лучевого поражения. Однако этот метод отражает только цитогенетические характеристики и не дает возможности определить локализацию патологии. Остальные методы более сложны в использовании и требуют дорогого оборудования для их осуществления, но позволяют исследовать клетки более детально. С помощью метода внутриклеточного микроэлектрофореза можно определить функциональное состояние человека и его биологический возраст
Метод определения конденсации хроматина показывает влияние стрессовых факторов на состояние организма и утомляемость человека при физических нагрузках. С помощью, описанных выше, методов можно исследовать отдельные структуры клетки. Но для более объективной оценки функционального состояния человека по буккальному эпителию необходимо использовать комплексный подход.
Буккальный эпителий для чего
Материалы и методы исследования
Клетки буккального эпителия получали путем соскоба с внутренней поверхностимаксиллярной зоны щеки, выше линии смыкания зубов, на уровне 5-6 зубов.Перед взятием мазка проводилась гигиеническая оценка состояния полости рта. Мазок-соскоббрался одноразовым пластмассовым шпателем из интактных участков слизистой оболочки щеки без травмирования слизистой оболочки. Полученный материал переносили на предметные стекла, высушивали, фиксировали в абсолютном спирте. Окраска по Паппенгеймупроизводилась в 2 этапа: в первый окрашивали метиленовым синим по Май-Грюнвальду (15 мин), во второй- азур-эозином по методу Романовского-Гимзе в течении 25 мин.
Результаты исследования и их обсуждение
Содержание эпителиоцитов3 стадии в цитограмме у здоровых детей составило1,8±0,1%. Они имеют овальную форму и умеренно-базофильную цитоплазму. Ядра клеток отличаются хорошо выраженным рисунком хроматина, имеющим нежносетчатый характер.У детей с аномалиями зубочелюстной системы до ортодонтического леченияих содержаниеувеличилось почти в два раза и равнялось 3,9±0,61%. В начальный период леченияпродолжалось их увеличение до6,7±0,63%. В период стабилизации наблюдалось снижениедо 4,4±0,72%. Взаключительный периодоно равнялось 2,7±0,52%Содержание эпителиоцитов 4 стадии у здоровых детей составило 20,3±0,5%. Они характеризуются полигональной формой. Цитоплазма выглядит слабобазофильной, гомогенна, серо-голубого цвета. Ядра клеток, по сравнению с предыдущей стадией, уменьшаются в размере, структура ядер более грубая, на фоне хроматиновой сети довольно часто встречаются интенсивно окрашенные комки хроматина. До начала ортодонтического лечения и в процессе лечения их содержание сохранялось на значениях 20,7±0,58%; 19,6±0,56%; 20,6±0,49%. И в заключительный период оно равнялось 19,9±0,37%.
Рис. Процентное содержание буккальныхэпителиоцитовв процессе ортодонтического лечения
В начальный период лечения вцитограмме повышалось содержание клеток II и III стадий дифференцировки, наблюдалось снижение содержания эпителиоцитовV и V стадий Выявлялись многоклеточные эпителиальные комплексы, что свидетельствовало о разрыхлении эпителиального пласта, нарушении межклеточных связей и десквамации эпителиальныхклеток.. У 75% обследованных детей отмечен катарральный гингивит и локальный парадонтит.
Заключение
Полученные данные позволяют рекомендовать цитологическое исследование буккального эпителия в качестве одного из индикаторов нарушений гомеостаза ротовой полости в процессе ортодонтического лечения аномалий развития зубочелюстной системы у детей.
Изменение цитологического состава соскоба эпителия слизистой в виде появления парабазальных клеток, многоклеточных комплексов, голоядерных клеток и увеличении числа нейтрофилов позволяет своевременно диагностировать катаральный гингивит и локализованный пародонтит с целью проведения лечебных и реабилитационных мероприятий.
Буккальный эпителий для чего
Микроядерный тест с успехом используется при проведении клинических исследований. Регистрация структурно-функциональных изменений, при которых в клетках выявляется наличие микроядер, представляет собой высокоинформативный и вместе с тем простой в техническом отношении метод оценки влияния на организм различного рода факторов [7]. Некоторые исследователи рекомендуют применение метода учета клеток с микроядрами для массового скрининга лиц, предрасположенных к нестабильности генома, с целью их последующей диспансеризации [8].
В настоящий момент широко распространен микроядерный тест в эпителиоцитах слизистой оболочки ротовой полости человека в связи с отсутствием необходимости в специальном лабораторном оборудовании, сравнительной простотой, быстротой и дешевизной этого анализа. Следует также отметить, что буккальный эпителий является своеобразным «зеркалом», отражающим состояние всего организма в целом [3]. Поэтому результаты микроядерного теста в клетках данного типа могут служить показателем действия на организм эндо- и экзогенных факторов, вызывающих численные и структурные аберрации хромосом и приводящие к образованию микроядер [19, 20]. Повышенный уровень микроядер в клетках слизистого эпителия полости рта может служить своеобразным сигналом различных патологических состояний организма (аллергозы, паразитарные инвазии, некоторые генетические болезни), косвенно указывая на нарушения в работе иммунной системы организма [18].
Выполнены работы по определению частоты буккальных клеток с микроядрами у пациентов с пигментной ксеродермой [29], у опухолевых больных [10], у больных оральной и фарингиальной карциномой, алкоголиков [28], у детей, страдающих хроническим тонзиллитом [30], и больных гастродуоденитом [15], при различных инфекционных заболеваниях (брюшной тиф, дизентерия и др.) [8], у больных клещевым энцефалитом [9], у больных шизофренией с непрерывным типом течения [12], при пародонтите [12], у больных системной красной волчанкой [26], при аллергических состояниях [1], у часто болеющих (более 4 раз в год) острыми респираторными заболеваниями детей [27]. Однако не изучено влияние патологических состояний, обусловленных сахарным диабетом I типа, на уровень клеток с цитологическими нарушениями у подростков.
Сахарный диабет занимает третье место по распространенности в мире после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний и представляет важнейшую проблему для современной медицины вследствие частой встречаемости, высокой ранней инвалидизации, смертности по причине развития поздних сосудистых осложнений, значительных экономических затрат общества на лечение. Эпидемиологические исследования в разных странах свидетельствуют об увеличении количества случаев возникновения сахарного диабета I типа у детей и подростков. Именно в этом возрасте данная болезнь представляет собой тяжелое страдание, которое меняет весь жизненный уклад семьи, требует пристального внимания, больших физических и эмоциональных усилий, экономических затрат со стороны ребенка и родителей, работников органов здравоохранения и общества в целом [6].
При сахарном диабете I типа в крови больных уменьшается количество общего белка, повышается концентрация креатинина и мочевины, уровень холестерина и триглицеридов превышает нормы [25], отмечается снижение общего состояния здоровья, ролевого физического, социального и эмоционального функционирования [4], что может отразиться на стабильности генома больных.
В связи с вышесказанным целью работы стало установление стабильности генетического аппарата организма подростков, больных сахарным диабетом I типа, с использованием микроядерного теста в буккальном эпителии ротовой полости.
Материал и методы исследования
Было обследовано 24 подростка (9 девушек и 15 юношей) в возрасте 12–14 лет, больных сахарным диабетом I типа, находящихся на стационарном лечении в БУЗ «Воронежская областная детская больница №1».
Лечение проводили инсулином ультракороткого действия НовоРапид в дозах от 5 до 12 ед. При поступлении и выписке у больных определяли концентрацию глюкозы в крови глюкозоксидазным методом на анализаторе «Humаlizer» (Германия).
Сбор материала (при поступлении больных в стационар и выписке), приготовление временных препаратов буккального эпителия слизистой ротовой полости, их анализ осуществляли по разработанной ранее методике [11].
Для анализа микроядер отбирали отдельно лежащие клетки с непрерывным гладким краем ядра. Микроядро идентифицировали как хроматиновое тело округлой или овальной формы с гладким непрерывным краем, размером не более 1/3 ядра, лежащее четко отдельно от него, не преломляющее свет, имеющее интенсивность окрашивания и рисунок хроматина как у основного ядра и находящееся в одной плоскости с ядром [23]. Также проводили анализ других типов аберраций (протрузии типа «язык», «разбитое яйцо», насечки, перинуклеарные вакуоли), согласно рекомендациям Юрченко [24].
Для каждого обследуемого вычисляли частоту встречаемости клеток с микроядрами, перинуклеарными вакуолями, насечками, протрузиями типа «разбитое яйцо» и «язык» как отношение числа клеток с той или иной аберрацией к общему числу проанализированных клеток (в ‰), частоту аберраций всех типов – как отношение суммы клеток с перечисленными нарушениями к общему числу проанализированных клеток (в ‰). Определяли спектр нарушений как отношение числа клеток с той или иной аберрацией к общему числу клеток с нарушениями морфологии ядра (в %).
Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета статистической программы Stadia. Процедура группировки данных и их обработка изложены в работе Кулаичева [17]. Сравнивали частоту встречаемости буккальных эпителиоцитов с аномалиями у больных с использованием непараметрических Х–критерия Ван–дер–Вардена и Вилкоксона, так как распределение частот встречаемости аберрантных клеток не подчиняется нормальному закону. Для выявления влияния пола и лечения на частоту клеточных патологий и концентрацию глюкозы в крови использовали двухфакторный дисперсионный анализ. Силу влияния фактора определяли по Снедекору (в %). Сравнение частот нарушений в спектре проводили с использованием Z-апромаксимации для критерия равенства частот. Корреляционные связи между показателями вычисляли с использованием параметрического коэффициента корреляции (r).
Результаты исследования
и их обсуждение
Установлено влияние пола и лечения на уровень глюкозы в крови обследуемых лиц (сила влияния 8,2 % (Р Примечание: * – различия с показателем у девушек достоверны (P Примечание: * – влияние фактора достоверно (P