регенераторная способность костного мозга
Медицинские интернет-конференции
Языки
Патогенетическое обоснование интерпретации результатов общего анализа крови
Рогова Л.Н., Губанова Е.И., Панкова Г.В., Шепелева Т.И.
Резюме
Целью лекции является актуализация причин и механизмов развития качественных и количественных изменений в общем анализе крови при анемическом синдроме, эритроцитозах, реактивных состояниях лейкона и опухолевых состояний системы крови.
Ключевые слова
Обзор
Цель лекции: актуализация причин и механизмов развития типовых качественных и количественных изменений в общем анализе крови.
Вопросы лекции:
1. Показатели общего анализа крови.
2. Патофизиологическая оценка анемического синдрома.
3. Причины и механизмы развития эритроцитозов.
4. Понятие о тромбоцитозах и тромбоцитопениях.
5. Количественные и качественные изменения клеток белой крови. Значение лейкоцитарной формулы для клиники.
6. Патогенетическое обоснование изменений СОЭ.
Показатели общего анализа крови
Оценка показателей общего анализа крови невозможна без системного подхода, включающего анализ конкретных данных и клинических проявлений болезни с учетом гемопоэза и гемодиэреза. Интерпретация всех показателей общего анализа крови проводится с позиций понимания морфофункциональных единиц системы крови, а именно, эритрона и лейкона.
Применение дополнительных клинических исследований, таких как, изучение пунктата костного мозга, трепанобиопсии плоских костей и некоторых биохимических тестов, позволяет выяснить функциональные резервы в системе эритрона и лейкона, уровень компенсации нарушенных функций, что, в конечном счете, определяет патогенетическую коррекцию нарушенных функций и успешность лечения больного.
Общий анализ крови включает:
1) определение содержания гемоглобина;
2) подсчет количества эритроцитов, ретикулоцитов, тромбоцитов и лейкоцитов;
3) определение и расчет индексов красной крови (цветового показателя, гематокрита; объема и диаметра эритроцитов) и выявление осмотической резистентности эритроцитов;
4) подсчет лейкоцитарной формулы;
5) определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ).
Качественные и количественные характеристики клеток крови выявляются
не только при помощи микроскопии (ручной способ подсчета общего анализа крови),
но и автоматически при аппаратном подсчете показателей крови. После определения содержания гемоглобина и количества эритроцитов проводят анализ индексов красной крови. В частности, автоматический подсчет позволяет получить следующие индексы красной крови:
Среди индексов красной крови особое место занимает гематокритная величина (Htc- гематокрит).
Определение гематокрита используют в качестве:
1) простого скрининг- теста для выявления анемии,
2) стандарта калибровки автоматизированных систем анализа крови,
3) критерия правильности определения уровня гемоглобина в крови.
Гематокрит приблизительно в три раза ниже уровня гемоглобина, выраженного в г/л.
Вместе с оценкой уровня гемоглобина и количества эритроцитов гематокрит можно использовать для вычисления эритроцитарных индексов.
Однако его использование в небольших лабораториях ограничено (необходимо наличие специальной центрифуги и большого количества капиллярных трубок).
Все перечисленные индексы используют для оценки системы красной крови (эритрона).
Патофизиологическая оценка анемического синдрома
Цветовой показатель (ЦП) в норме у мужчин и женщин соответствует 0,86-1,1. По величине этого показателя судят о степени насыщения гемоглобином одного эритроцита, при ручном подсчете показателей красной крови он рассчитывается делением утроенной величины гемоглобина на первые три цифры гемоглобина.
Аппаратное определение остальных индексов красной крови позволяет выработать алгоритм разделения анемий, основанный на выявлении, прежде всего, нормохромного, гипохромного и гиперхромного состояния (табл. № 1)
Состояние, характеризующееся снижением количества эритроцитов в единице объема крови меньше 3,7 у женщин и 4,0 у мужчин, называют эритропенией. Эритропения без снижения гемоглобина явление редкое, поэтому этот термин используют при характеристике анемии, либо почти не используют.
Анемия – это синдром, для которого характерно снижение содержания гемоглобина и эритроцитов (или изменение их качества) в единице объема крови.
Большинство анемий сопровождаются эритропениями. Исключением являются железодефицитные состояния и талассемия. С клинической точки зрения, основным и обязательным признаком анемии является снижение содержания гемоглобина в единице объема крови. Именно этот факт определяет уменьшение кислородной емкости крови и приводит к гипоксии гемического типа. В свою очередь, гемическая гипоксия, как ведущее звено патогенеза любой анемии, определяет основные клинические симптомы и расстройства жизнедеятельности у больных с анемическим синдромом.
Анемии, как правило, сопровождаются олигоцитемической нормоволемией, снижением гематокрита и ускорением СОЭ. Анемии часто являются синдромом какого-то другого заболевания, а не самостоятельными болезнями. В связи с этим строгая нозологическая или патогенетическая классификация анемий (с учетом основного заболевания) отсутствует.
Алгоритм разделения анемий по эритроцитарным индексам
нормо- и гиперхромные
RDW норма или увеличен
MCV в пределах нормы
MCH в пределах нормы
MCHC в пределах нормы
RDW обычно в пределах нормы
MCHC в пределах нормы
Нарушение синтеза и утилизации порфиринов
Гетерозиготная талассемия и др.
Анемии при заболеваниях почек,
гипопластические анемии, острая постгеморрагическая анемия,
В12 – дефицитная анемия, фолиеводефицитная анемия, анемия при хронических заболеваниях печени,
Для оценки регенераторной способности костного мозга проводят подсчет ретикулоцитов. У здоровых лиц в периферической крови обнаруживают 0,2-1,2% ретикулоцитов. Состояния эритропоэза определяют как:
1) регенераторные (0,2-1,2%),
2) гиперрегенераторные (больше 1,2%),
3) гипорегенераторные (меньше 0,2%),
Определение осмотической резистентности эритроцитов
Осмотическую резистентность эритроцитов исследуют в качестве дополнительного лабораторного теста для выявления нарушений физико-химических свойств крови и качественных изменений эритроцитов.
На осмотическую резистентность эритроцитов влияют:
2) возраст эритроцитов;
3) осмотические свойства плазмы крови.
Начало гемолиза эритроцитов в гипотоническом растворе хлорида натрия у здоровых людей колеблется в пределах 0,46-0,44% NaCl и соответствует минимальной резистентности.
Полный гемолиз эритроцитов наступает при 0,32-0,28% NaCl и соответствует максимальной резистентности эритроцитов к гипотоническому раствору.
Форма эритроцитов оценивается по индексу сферичности, который определяется соотношением толщины эритроцита к его диаметру. В норме он равен 0,27-0,28. Чем выше индекс сферичности, чем шарообразнее эритроцит, тем ниже его осмотическая резистентность. Самый низкий индекс сферичности у созревающих эритроцитов – ретикулоцитов. При заболеваниях, сопровождающихся высокой регенераторной способностью красного костного мозга, выявляются увеличение ретикулоцитов и осмотической резистентности эритроцитов. В случаях, если патологический процесс сопровождается повышением осмотического давления плазмы – осмотическая резистентность повышается; в противном случае – снижается.
Причины и механизмы развития эритроцитозов
Эритроцитоз – это увеличение содержания эритроцитов в единице объема крови свыше 4,7х10 12 у женщин и 5,1х10 12 у мужчин.
Эритроцитозы
А. Первичные (самостоятельные формы болезни):
Эритремия (истинная полициемия, болезнь Вакеза),
Семейные (наследственные) эритроцитозы.
В. Вторичные или симптоматические эритроцитозы:
абсолютные, которые развиваются вследствие усиления эритропоэза и элиминации эритроцитов в сосудистое русло из костного мозга;
относительные (гемоконцентрационные или гиповолемические), обусловленные уменьшением объема крови за счет плазмы.
По этиологии и патогенезу болезнь Вакеза относят к числу лейкозов. В основе механизма развития эритроцитоза при болезни Вакеза лежит увеличение количества и неограниченная пролиферация клеток-предшественниц миелопоэза в костном мозге, селезенке и других органах, содержащих клетки гемопоэтической системы. Следствием миелопролиферативного процесса опухолевой природы является увеличение эритроцитов в периферической крови и одновременное обнаружение гранулоцитоза, моноцитоза и тромбоцитоза. Такое явление обозначается как полицитемия. Для болезни Вакеза характерно развитие явления плеторы, т.е. переполнения органов и тканей кровью, содержащей большое количество клеток. Полицитемия обусловливает резкое увеличение вязкости крови, что проявляется реологическими нарушениями в сосудах микроциркуляторного русла и неизбежно ведет к замедлению кровотока, сладжированию, микротромбообразованию и стазу. При болезни Вакеза высока частота нарушений кровообращения в сосудах мозга, сердца, почек и др. органов.
Наряду с тромбозом у пациентов с эритремией нередко наблюдается наклонность к кровотечениям. Кровотечения связывают с нарушением функции измененных в результате опухолевого процесса эритроцитов и тромбоцитов, а также потреблением факторов свертывания крови в условиях диффузного тромбообразования.
Наследственный (семейный) эритроцитоз.
На сегодняшний день этиология и патогенез заболевания мало изучены. Отличается это заболевание от болезни Вакеза неопухолевым характером активации пролиферации эритроидных клеток костного мозга.
Непосредственной причиной вторичных абсолютных эритроцитозов является повышение образования эритропоэтина.
Наиболее часто это обусловливают следующие состояния:
1) хроническая гипоксия любого генеза. Эритроцитоз при гипоксии имеет компенсаторный характер.
2) локальная ишемия почки или обеих почек, реже печени, селезенки (при кистах в них; отеке; стенозе артерий; воспалении);
3) опухолевый рост, сопровождающийся продукцией эритропоэтина (опухоли почек, печени, селезенки);
4) высокогорье (развивается адаптивный эритроцитоз).
При вторичных абсолютных эритроцитозах имеют место признаки диффузной активации пролиферации эритрокариоцитов в костном мозге в сочетании с увеличением концентрации эритропоэтина в плазме крови. Содержание ретикулоцитов может достигать 2-10%. Наблюдается умеренная полицитемическая гиперволемия, повышение вязкости крови и гематокрита. В сосудах микроциркуляторного русла возможны агрегаты эритроцитов и микротромбы. Нередко повышается АД и нагрузка на сердце.
Понятие о тромбоцитозах и тромбоцитопениях
Число тромбоцитов у здоровых лиц составляет от 180∙10 9 /л до 320∙10 9 /л (в зависимости от метода исследования).
Тромбоцитоз – увеличение числа тромбоцитов выше 400∙10 9 /л.
Первичный тромбоцитоз – результат увеличения пролиферации тромбоцитов в костном мозге, редко имеет изолированный характер, чаще – проявление миелоидной метаплазии костного мозга. Наблюдается при эритремии, хроническом миелолейкозе и миелофиброзе.
Вторичный тромбоцитоз возникает на фоне какого-либо заболевания. Вторичный тромбоцитоз (реактивный) обычно не столь выражен как первичный, реже осложняется тромбозом или кровотечением и исчезает при устранении причины.
Тромбоцитопения – имеет значение в клинической практике, если число тромбоцитов ниже 60∙10 9 /л сопровождается геморрагическим синдромом.
Количественные и качественные изменения клеток белой крови. Значение лейкоцитарной формулы для клиники
У здоровых взрослых людей в периферической крови количество лейкоцитов регистрируют в пределах от 4 до 9∙10 9 /л.
Основная функция зрелых лейкоцитов – обеспечение неспецифической и специфической резистентности организма на клеточном уровне. Регуляция срочного перераспределения лейкоцитов из депо осуществляется гормонами стресса и сопровождается лейкоцитозом.
При срочной адаптации содержание лейкоцитов в крови пополняется из двух депо:
1) маргинальный пул (зрелые нейтрофилы);
2) костномозговой резерв (с помощью радиоизотопного метода установлено, что при патологических процессах быстрое нарастание числа гранулоцитов за счет мобилизации из костного мозга начинается на 5-е сутки и сопровождается палочкоядерным сдвигом влево).
Количественные изменения в лейконе представлены:
1) поликлональными реактивными состояниями (лейкоцитозы, лейкопении);
Качественные изменения лейкона бывают:
2. Дегенеративными (к/м – малоклеточный; в крови преобладают зрелые и отсутствуют созревающие лейкоциты). Выявляют кариопикноз, кариорексис, гиперсегментацию ядер; токсическую зернистость, вакуолизацию цитоплазмы; наличие в лейкоцитах патологических включений.
3. Патологические изменения характерны для лейкозов. Лейкоциты похожи на нормальные клетки, но свои функции в тканях не выполняют.
Чаще всего в ответ на повреждения со стороны лейкона развивается лейкоцитоз, реже – лейкемоидная реакция и лейкопения.
Лейкоцитозы и лейкопении могут быть физиологическими и патологическими.
имеют кратковременный характер.
Механизм возникновения физиологических количественных изменений лейкоцитов периферической крови – это их перераспределение, как правило, зрелых нейтрофилов из маргинального пула посткапиллярных венул.
В патологии наиболее частыми причинами реактивных изменений белой крови являются:
1) инфекции и септические состояния;
2) асептические некрозы тканей (инфаркт миокарда, почки, селезенки, асептический некроз головки бедренной кости);
3) аутоиммунные повреждения тканей (коллагенозы);
4) метастатическое поражение костного мозга.
Разновидностью реактивного лейкоцитоза в патологии является лейкемоидная реакция. Лейкемоидная реакция – всегда проявление гиперергического ответа на действие повреждающего фактора чрезмерной силы. Она развивается при крайне тяжелом течении заболевания и исчезает после применения адекватных методов лечения. Следует помнить, что в динамике развития болезни лейкоцитоз может смениться лейкемоидной реакцией с последующим развитием лейкопении, что отражает включение защитных резервов со стороны лейкона и их истощение.
Качественные и количественные патологические изменения в лекойне наблюдаются при лейкозах. Лейкозы – это опухоли кроветворной системы, развивающиеся в костном мозге. Мишенью опухолевой трансформации при лейкозах являются кроветворные бипотентные и унипотентные клетки-предшественницы, реже стволовая кроветворная клетка.
Особенностью лейкозов является системный характер. Системность может быть изначальной, развиваться постепенно по ходу заболевания, но может и отсутствовать в течение долгого времени. Лейкозам свойственно: первичное поражение костного мозга и преимущественно диффузная инфильтрация кроветворных органов опухолевыми клетками.
Первичный лейкозный клон какое-то время сосуществует с нормальным клоном, но, обладая преимуществом в росте, опухолевый клон приводит к сокращению объема нормального кроветворения, что проявляется панцитопенией (анемией, тромбоцитопенией, нейтропенией). Следовательно, накопление лейкозной массы сопровождается развитием недостаточности костномозгового кроветворения. Угнетение нормального гемопоэза может быть связано также с выработкой опухолевыми клетками ингибиторов гемопоэза.
Все лейкозы делят на острые и хронические.
Субстрат острых лейкозов представлен только бластными клетками, которые не способны к дефференцировке.
При хронических лейкозах субстрат опухоли представлен клоном клеток, родоначальница которых способна к дифференцировке.
По направленности дифференцировки острые и хронические лейкозы разделяют на миелогенные и лимфогенные.
В настоящее время среди различных классификаций лейкозов наибольшее признание получила классификация франко-американо-британской группы экспертов (FAB, 1976, 1991).
Принцип классификации – морфоцитохимический (1976) с применением методов феноиммунотипирования и цитогенетического анализа (1991).
Согласно этой классификации при миелогенных острых лейкозах различают семь типов бластных клеток (1976, 1991).
• М0 – острый миелобластный лейкоз с минимальной миелоидной дифференцировкой бластов.
• М1, М2, М3 – преимущественно гранулоцитарная дифференцировка клеток, различающаяся степенью цитоплазматической «зрелости»:
• М4, М5 – преимущественно моноцитарная дифференцировка лейкозных клеток:
• М6 – острый эритромиелоз (эритробластный) лейкоз;
• М7 – острый мегакариобластный лейкоз.
Среди острых лимфобластных лейкозов (ОЛЛ) выделено три типа:
• L1 – ОЛЛ, встречающийся у детей,
• L2 – ОЛЛ взрослых и
• L3 – редкие случаи ОЛЛ с бластными элементами, морфологически напоминающими лимфому Беркитта.
В диагностике ОЛЛ обязательное иммнофенотипирование опухолевых клеток позволяет выявить Т- или В-клеточную природу ОЛЛ.
Хронические миелоидные и лимфоидные лейкозы обозначают как миело- и лимфопролиферативные заболевания.
Миелопролиферативные заболевания:
1. Хронический миелолейкоз;
2. Сублейкемический миелоз (миелофиброз, остеомиелосклероз);
3. Эритремия (истинная полицитемия);
4. Хронический миеломоноцитарный лейкоз;
5. Хронический моноцитарный лейкоз;
6. Хронический мегакариоцитарный лейкоз (идиопатическая тромбоцитемия).
Хронические лимфогенные опухоли разделяют на Т- и В-клеточные лимфопролиферативные заболевания.
2. Для первичного расположения опухолей при лимфопролиферативных заболеваниях вне костного мозга используется термин «лимфосаркома».
В зависимости от общего количества лейкоцитов и наличия бластов в периферической крови различают следующие формы лейкозов:
1) лейкемические (Лейкоцитоз >50 Г/л, много бластов);
Регенераторная способность костного мозга
В современной медицине в связи с учащением возникновения заболеваний нервной системы довольно остро стоит вопрос о возможности восстановления функционально полноценных нервных клеток. Нейроны имеют довольно ограниченную энергозависимую способность к репаративной регенерации, а сами по себе очень чувствительны к физическим и химическим воздействиям, таким как нейрональная гипоксия, окислительный стресс, а также к нейротоксинам. В связи с этим актуальным является не только вопрос синтеза эффективных нейропротективных препаратов, но и сама возможность стимуляции пролиферации собственной нервной ткани, или нейротрансплантация [1].
Нужно учитывать, что возможность замещения погибшей нервной ткани ограничена: при массивных повреждениях замещение дефицита нервной ткани идет по пути глиальных элементов, что, как известно, не восполняет функционального дефицита поврежденной нервной ткани [2].
Ранее утверждение о том, что нервная ткань не способна к репаративной регенерации с восполнением тканевого дефекта зрелыми нейронами, считалось аксиомой, как и то, что нервные стволовые клетки (НСК) существуют в организме только во время эмбрионального развития. Но J. Altman в своих исследованиях подтвердил возможность регенерации нервной ткани, обнаружив в ЦНС делящиеся клетки, участки локализации которых были названы впоследствии нейрогенными нишами [2]. Такие клетки при определенной стимуляции могут проявлять свойства НСК. У взрослых млекопитающих они преимущественно локализуются в латеральных стенках боковых желудочков головного мозга, а также в зернистом слое зубчатой извилины гиппокампа, где нейрогенез идет параллельно с ангиогенезом [3–5]. Так же они обнаруживаются в эпендимальной зоне спинного мозга, обонятельных луковицах и обонятельном эпителии млекопитающих [6–8]. В литературе встречается информация о предполагаемой возможности нейрогенеза в области черной субстанции и миндалин [9]. Эмбриональный нейрогенез устанавливает нейронную архитектуру и функцию в глобальном масштабе, тогда как нейрогенез во взрослом организме играет более ограниченную роль [8]. Такой нейрогенез способствует формированию и поддержанию памяти у взрослого человека, а нейробласты, дифференцированные из НСК, также участвуют в поддержании гомеостаза головного мозга [4, 5]. Повреждение нервной ткани или воздействие на нее факторов роста в ЦНС стимулирует нейрогенез в данных зонах, а нейродегенеративные процессы, в том числе возрастные изменения, способствуют нарушению регуляции нормального нейрогенеза, вызывая неврологический дефицит [4]. На данный момент нет детального понимания механизмов, которые поддерживают пул нейральных стволовых клеток при обеспечении пожизненного нейрогенеза. К примеру, факторы, способствующие покою и активации этих клеток, остаются в значительной степени неизвестными [7].
Стволовые клетки нервной ткани (НСК) дают начало двум ветвям нейрогенеза – нейрональной и глиальной, способны к дифференцировке в олигодендроциты и зрелые нейроны [10–12]. Предполагается, что хемокины, секретируемые в области нейровоспаления, способствуют миграции клеток-предшественников в зону поражения нервной ткани [13, 14]. Р.Р. Новиков в своей работе ссылается на данные, полученные S.O. Suzuki и J.E. Goldman при экспериментах на новорожденных крысах, указывающие на миграцию клеток в кору больших полушарий и белое вещество мозга с последующей специализацией путем дифференцировки в олигодендроциты и астроциты, а также в зону обонятельной луковицы с последующей дифференцировкой в зрелые нейроны [15]. Стволовые клетки способны мигрировать в зону повреждения по сосудам, по нейронным цепям и глии, а также по астроцитарным отросткам [16]. Мигрировавшие стволовые клетки либо трансплантированные клетки-предшественники способны к восстановлению функциональной способности ткани двумя путями: встраиваясь в ткань-мишень и становясь его частью, либо оказывая терапевтическое воздействие на ткань-мишень без непосредственной интеграции [17]. В то же время нервная ткань взрослого человека регенерирует в разы медленнее, чем нервная ткань зародыша в эмбриональном периоде [4].
Доказано, что существует возможность применения стволовых клеток путем стимуляции эндогенных стволовых клеток, а также трансплантации экзогенных стволовых клеток из различных тканей, размноженных in vitro [14]. Путем проведения множественных экспериментальных трансплантаций было доказано, что успех или неудача в применении клеточных технологий для восстановления функционально полноценной ткани зависит именно от морфологических и функциональных особенностей пересаживаемых стволовых клеток [18].
Таким образом, целью данного аналитического обзора является рассмотрение возможности и способов применения стволовых клеток, полученных из различных тканей, в качестве стимулятора репаративного нейрогенеза.
Трансплантация нервных стволовых клеток в стимуляции репаративного нейрогенеза
Проведены исследования возможности использования для стимуляции нервной регенерации трансплантированных нервных стволовых клеток.
Ученые приводят результаты доклинических исследований, показывающие благоприятное влияние НСК на электрофизиологическое и морфологическое восстановление хронически поврежденного нерва подопытных мышей и крыс [19].
Стволовые клетки, используемые для стимуляции нервной регенерации, могут быть пересажены в их недифференцированном состоянии или пройти период дифференцировки in vitro [19]. При этом нейрональные стволовые клетки, трансплантированные без предварительной обработки in vitro, проходят дифференцировку в основном в клетки глии, реже – в нейроны [14]. S. Lin et al. культивировали эмбриональные клетки крысиного спинного мозга до момента их дифференцировки в клетки нейрональной и глиальной линии, затем пересаживали их в дистальную часть поврежденного большеберцового нерва крысы на седьмые сутки после нанесения травмы и добились анатомического восстановления нерва и тем самым восстановления иннервации икроножной мышцы. Ученые называют срок в 7 дней после получения травмы наиболее оптимальным временем использования НСК для сохранения мышечной иннервации при повреждении периферического нерва [20].
В тоже время существуют исследования, экспериментально опровергающие возможность использования HCК для восстановления нервной ткани. В ряде случаев НСК показывают плохую выживаемость и ограниченное положительное воздействие в зоне поражения с незначительным функциональным улучшением [21].
Hongyun Huang et al. в своем обзоре приводят информацию о том, что трансплантированные в головной мозг незрелые астроциты способны изменять микросреду головного мозга крыс, синтезируя нейротрофины, необходимые для выживания окружающих нейронов и уменьшая образование глиальных рубцов, тогда как зрелые астроциты, напротив, стимулируют их образование и препятствуют росту аксонов нейронов [22]. Танациты, трансплантированные в спинной мозг крыс, также способны поддерживать регенерацию поврежденных аксонов [22]. В то же время многие ученые отвергают теорию о значимой роли в нейрогенезе эпендимальных стволовых клеток, в связи с отличиями их пролиферативной активности от таковой способности у нейрональных предшественников [23].
Попытки использования клеток фетального мозга также дали неоднозначные результаты благодаря неоднородности самой популяции таких клеток, полученных in vivо и in vitro. Такие клетки, кроме как популяциям зрелых нейронов, продуцирующих нейромедиаторы порой противоположного друг другу действия, дают начало также глиальным элементам. Эта особенность не дает полной уверенности в безопасности данного метода [2].
Трансплантация эмбриональных стволовых клеток в стимуляции репаративного нейрогенеза
Эксперимент И.С. Брюховецкого показал способность эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) к дифференцировке в нейрональные клетки, способные к секреции соответствующих маркеров, при культивировании на коллаген-хинозановой конструкции «Коллахит-бол» [24]. В то же время трансплантированные ЭСК по мере дифференцировки могут вызвать реакцию отторжения в связи с приобретением ими иммуногенных свойств [10]. Также экспериментально доказано, что использование NeuroGelTM в сочетании с ксенотрансплантацией стволовых клеток нервного гребня для лечения неврологических осложнений при травме спинного мозга на крысиной модели не только не дает ожидаемых положительных результатов, но и усугубляет посттравматические неврологические осложнения [25]. А А.П. Парахонский отмечает высокую онкогенную активность эмбриональных стволовых клеток, что, по его словам, не исключает существование широкой возможности дифференцировки эмбриональных стволовых клеток ex vivo только в качестве культурального феномена [26].
В литературе содержится множество результатов исследований, что демонстрирует активный поиск оптимальных способов активации нейрогенного потенциала стволовых клеток, существующих в организме человека и животных в постнатальном периоде [5].
Трансплантация клеток обонятельного эпителия в стимуляции репаративного нейрогенеза
Возможно, перспективным окажется использование постоянно пролиферирующих в течение всей жизни клеток обонятельного эпителия [2]. Обонятельный эпителий взрослого человека обладает уникальной регенераторной способностью благодаря клеткам-предшественникам, обеспечивающим непрерывную замену клеток на протяжении всей жизни [13].
Потенциально возможно использование обкладочных клеток обонятельного эпителия (OECs). Они схожи по фенотипу со шванновскими клетками периферической нервной системы и с астроцитами ЦНС. Их возможными источниками являются собственная обонятельная пластинка или слой нервных волокон обонятельной луковицы [13]. Также OECs способны продуцировать SDF-1 (stromal cell-derived factor-1) и BDNF (нейротрофический фактор мозга), усиливающие регенерацию аксонов [21]. Однако возможности использования обкладочных клеток обонятельного эпителия являются ограниченными в связи с недоступным расположением.
Начальные клинические испытания по применению обкладочных нейроэпителиальных клеток для восстановления нервной ткани после позвоночно-спинномозговой травмы у человека в 2005 г. не показали серьезных осложнений после проведенной трансплантации в начале постоперационного периода [28].
Особым преимуществом обладает аутологичная трансплантация размноженных ex vivo и клонированных желаемым фенотипом клеток обонятельного эпителия, так как не возникает необходимости в иммуносупрессии. Кроме того, не возникает этических проблем, связанных с изъятием материала для трансплантации [13]. В России проведенная в рамках клинических испытаний оперативная трансплантация аутогенных клеток обонятельного эпителия в препарате «Сферогель» привела к клиническому улучшению у испытуемых в 50 % случаев [10].
В то же время использование клеточной терапии в комбинации с нейротрофинами способно вызвать нежелательные эффекты. Например, Bretzner et al. [29], объединив для восстановления нейронов руброспинального тракта терапию BDNF с трансплантацией высокообогащенных клеток обонятельного эпителия, выявили, что данная терапия, так же как и терапия BDNF и клетками обонятельного эпителия по отдельности, предотвращает отмирание, но не стимулирует регенерацию руброспинального тракта за пределами участка поражения (зоны трансплантации). Кроме того, комбинация клеток обонятельного эпителия с BDNF с инфузией в красное ядро уменьшала и задерживала функциональное восстановление [29].
Трансплантация клеток костного мозга и мезенхимальных клеток другого происхождения в стимуляции репаративного нейрогенеза
Для стимуляции репаративного нейрогенеза исследовались два типа стволовых клеток костного мозга: SCs (гемопоэтических стволовых клеток костного мозга), BMSC (мезенхимальных (негемопоэтических) стволовых клеток костного мозга). В то же время использование таких стволовых клеток в экспериментах демонстрирует как положительные, так и отрицательные результаты [2].
1. Применение гемопоэтических стволовых клеток костного мозга (SCs)
Гемопоэтические стволовые клетки обладают экспериментально доказанной способностью к дифференцировке в клетки различных тканей организма, в том числе в нервные клетки [30]. Так, эксперимент Roubon et al. ставит под сомнение возможность дифференцировки высокоочищенных HSCs в нервные клетки, указывая, однако, на то, что их значительное количество способно принимать примитивные нейроподобные фенотипы, не способные к окончательной дифференцировке в нейроны [31]. S. Vitry et al., проводя попытки инициации дифференцировки HSCs в нейральном направлении, трансплантировали очищенные культивированные HSCs из AGM зоны (aorta-gonad-mesonephros region) мышей в желудочки головного мозга, выяснили, что, не вызывая отторжения, они дифференцируются в нормальные клетки микроглии и макрофаги мозга, но не способны к дифференцировке в нормальные нейроны или миелинизирующие олигодендроциты [32]. В экспериментах, проведенных Massensale et al. по трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (HSC) в мозг подопытных животных, было установлено, что трансплантированные клетки не проходят нейральную дифференцировку, превращаясь в гемопоэтические клетки [33].
Проведен ряд клинических исследований использования HSCs для стимуляции репаративного нейрогенеза. Так мобилизация HSCs гранулоцитарным колониестимулирующим фактором, введенным пациентам подкожно в рамках клинических исследований с последующей трансплантацией стволовых клеток костного мозга дает значительное улучшение в процессе восстановления сенсорной и моторной функции после полученной позвоночно-спинномозговой травмы [34]. В России так же была проведена аутогенная трансплантация HSCs в субарахноидальное пространство пациентам с травматической болезнью спинного мозга. По результатам эксперимента отмечен положительный эффект в 50 % случаев, при этом не выявлено посттрансплантационных осложнений. Однако ряд исследований указывает на значительное онкогенное действие подобной трансплантации [35].
2. Применение мезенхимальных (негемопоэтических) стволовых клеток костного мозга и мезинхимальных клеток другого происхождения
Scintu et al. в своих экспериментах использовали BMSC, обрабатывая их вариациями смеси FGF-1 (фактор роста фибробластов-1) с соактиваторами – РКС (активатор протеинкиназы С), ретиноевой кислотой, РКА (активатор протеинкиназы А, форсколин) и IBMX (3-изобутил-1-метилксантин) – с целью изучения их возможной дифференцировки по нейрональному фенотипу. Ученые выяснили, что после такой обработки BMSC становятся способны экспрессировать нейрональные маркеры. Однако данное свойство BMSС при обработке смесью активаторов РКС, РКА и FGF-1 носило временный характер, как и их дифференцировка – в течение суток клетки возвращались к своему первоначальному фенотипу. При обработке ретиноевой кислотой и BME (2-меркаптоэтанолом) клеточная дифференциация сохранилась после окончания действия активаторов и их удаления. BMSC при обработке данной смесью медленно дифференцировались в нейроноподобные клетки и по истечению семи дней с момента их обработки были способны экспрессировать NF-M (нейротрофический фактор мозга) [36].
Jia et al., исследуя эффективность использования бесклеточного нервного трансплантата (ANX) в сочетании с BMSCs для репаративной регенерации периферического нерва как альтернативу ANA (бесклеточному нервному аллотрансплантату), пришли к выводу, что данный метод способствует регенерации нерва путем стимуляции шванновских клеток реципиента и подходит для улучшения миелинизации и удлинения аксона поврежденного нерва [37].
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из тканей взрослого организма, потенциально являются терапевтически важным источником клеток для лечения нарушений в центральной и периферической нервной системе, поскольку обладают способностью как к нейрональной, так и к глиальной дифференцировке, а также экспрессируют многочисленные противовоспалительные и нейротрофические факторы, поддерживающие репарацию нервной ткани [38]. Введение МСК после инъекции в мозг крыс липополисахарида (ЛПС) увеличивало плотность астроцитарных филаментов вокруг сосудов головного мозга подопытных животных, а также снижало индуцированный влиянием ЛПС уровень VEGF-A. Таким образом, лечение МСК стабилизировало гематоэнцефалический барьер, уменьшило инфильтрацию нейтрофилами и повысило выживаемость дофаминэргических нейронов среднего мозга у животных, получивших лечение ЛПС [39]. М.Н. Карагяур и Н.И. Калинина упоминают о положительных результатах экспериментального лечения механической травмы периферического нерва мыши путем трансплантации мезенхимальных мультипотентных клеток стромы, способных продуцировать BDNF, GDNF и VEGF, в препарате MatrigelTM [40]. При экспериментальной имплантации культивированных ex vivo мезенхимальных стволовых клеток (МСК) животным с острым нарушением мозгового кровообращения наблюдалось клиническое улучшение благодаря проникновению клеток через ГЭБ в зону ишемии [6].
Ю.А. Калинина и др. в своей работе упоминают о взаимодействии трансплантированных мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (ММСК) и ишемизированной астроглии. ММСК стимулируют перестройку нервной ткани и переход предшественников нейротрофинов в их активную форму, а активные нейротрофины – NGF, BDNF – стимулируют рост аксонов. Авторы ссылаются на работы L.H. Shen et al., а также N. Pavlichenco et al., указывая, что воздействие ММСК на нервную ткань способствует сохранению жизнеспособности клеток области, граничащей с зоной повреждения и, таким образом, уменьшению размеров глиального рубца [41]. Существуют данные о том, что ММСК способствуют снижению проницаемости гематоэнцефалического барьера и, таким образом, стабилизируют его. Также эти клетки стимулируют выработку астроцитами ангиогенных факторов, запуская ангиогенез [41].
Некоторые эксперименты показали, что трансплантированные мезенхимальные стволовые клетки, взаимодействуя с иммунокомпетентными клетками, угнетают функциональную активность лимфоцитов, а также подавляют созревание дендритных клеток [42]. Е.С. Петрова, однако, в своей работе упоминает о том, что МСК, введенные в место повреждения аксона нерва, потенцируют его регенерацию. Вероятно, это связано со стимуляцией собственных эндогенных шванновских клеток, способных к синтезу BDNF, тем самым способствуя восстановлению нервного волокна. Так же МСК способны вырабатывать FGF и VEGF, которые способствуют регенерации поврежденной ткани, улучшая ее кровоснабжение [42].
L.G. Dai et al. в своей работе указывают на то, что культивирование МСК в определенных условиях повышает эффективность применяемой клеточной терапии. Так, например, совместное культивирование мезенхимальных стволовых клеток с леммоцитами способствует их дифференцировке в шванновские клетки (SCs), способные к усиленному синтезу и секреции нейротрофинов [43]. Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из желе Уортона, способны дифференцироваться в SC-подобные клетки, продуцирующие нейротрофины NGF, BDNF, NT-3, стимулирующие рост нейритов in vitro [19]. Возможна дифференцировка стволовых клеток в SC-подобные клетки посредством воздействия на них бета-меркаптоэтанола, форсколина, трансретиноевой кислоты, рекомбинантного человеческого bFGF, рекомбинантного человеческого тромбоцитарного фактора роста – АА. Стимулированная таким образом дифференцировка увеличивает жизнеспособность этих клеток in vivo, усиливает способность к секреции нейротрофинов, а также миелинизирующую способность [19].
Трансплантация шванновских клеток (нейролеммоцитов) в стимуляции репаративного нейрогенеза
Возможно трансплантирование и самих шванновских клеток (нейролеммоцитов, SCs). При повреждении периферического нерва они играют важную роль в процессе его восстановления, так как способные к синтезу нейротрофинов BDNF, NGF, VEGF [42].
Миграция SC, трансплантированных в белое вещество ЦНС, ингибируется астроцитами головного мозга, но при введении в демиелинизированную нервную ткань, способствуют ее миелинизации [22, 42]. По данным N.G. Fairbairn et al. шванновские клетки, являясь главными глиальными клетками периферической НС, после травматизации нерва, имея способность к переключению с миелинизирующего на фагоцитарный фенотип, стимулируют регенерацию аксона, посредством усиления хемотаксиса циркулирующих макрофагов в зону повреждения. Регенерирующая часть аксона образует симбиотическое соединение с SCs, способствующее росту аксонов [19].
Существуют данные о возможном использовании в терапевтических целях генетически модифицированных шванновских клеток, которые способствуют усилению роста и миелинизации аксонов нервных клеток [3, 22].
Использование трансплантации других видов клеток в стимуляции репаративного нейрогенеза
Имеются результаты использования трансплантатов, содержащих и другие клеточные культуры.
Исследование D. Kim et al. в стимуляции нейрогенной дифференцировки стволовых клеток жировой ткани (ADSCs) при помощи смеси активаторов и их применении для восстановления поврежденного периферического нерва крысы совместно с использованием нанокаркаса PCL (поликапролактон) показало, что данный метод лечения увеличивает степень нейрональной индукции поврежденного участка при использовании как нейронально дифференцированных, так и недифференцированных ADSCs [40]. Авторы также указывают на потенциальную возможность совместного с ADSCs использования FGF, NGF, GGF (глиального фактора роста), CNTF (цилиарного нейротрофина), VEGF (эндотелиальный фактор роста сосудов), NT-3 и BDNF для увеличения нейротропного потенциала клеток путем модуляции микросреды [44].
Стволовые клетки пульпы зуба (DPSC), происходящие из краниального нервного гребня, обладающие такими МСК-подобными характеристиками, как способность к самообновлению и многолинейной дифференцировке, можно получить из ткани пульпы зуба, в том числе третьих моляров. DPSC обладают высокой пролиферативной способностью, способны дифференцироваться в шванноподобные клетки и олигодендроцитарные клетки и секретировать нейрональные маркеры, например GFAP (глиальный фибриллярный кислый белок), а также нейротрофины [38, 45]. Дентальные стволовые клетки участвуют в нейрорегенерации путем замены погибших клеток, напрямую дифференцируясь в нейроподобные клетки, либо привлекая эндогенные нейральные стволовые клетки при проведении процедуры их трансплантации в зону повреждения [45]. Так же эти клетки способны снижать нейродегенерацию на ранних стадиях апоптоза нейронов и способствовать выживанию моторных и сенсорных нейронов поврежденного спинного мозга за счет секреции BDNF и NGF, а также трофических факторов, способствующих регенерации аксонов [38]. В контролируемых условиях in vitro существует возможность дифференцировать их в нейронные линии, экспрессирующие многочисленные нейронные маркеры, или в спиральные ганглиозные нейроноподобные клетки путем их обработки BDNF, NT-3, GDNF [38]. Однако до сих пор неясно, какой из методов является наиболее подходящим для нейральной дифференцировки стволовых клеток зубов [45].
Существуют исследования о применении DPSC в лечении инсульта, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, повреждений сетчатки, а также повреждений периферических нервов. Некоторые исследования in vivo показали, что трансплантация стволовых клеток дентальной пульпы в ишемизированные зоны при окклюзии средней мозговой артерии у крыс способствовала восстановлению локомоторных функций и уменьшению площади инфаркта за счет их дифференцировки в дофаминэргические нейроны и секреции нейротрофических факторов [38].
В регенеративной медицине нашли применение MDSC (стволовые клетки мышечного происхождения). Искусственно культивируемые MDSC способны к дифференцировке в нейрональные и глиальные клетки, однако до настоящего времени не достигнут консенсус в отношении эффективных протоколов культивирования и индукции для нейронной дифференцировки MDSC [46].
Способы трансплантации клеток и стимуляторов дифференцировки стволовых клеток
Вопрос о возможности применения клеточных технологий в клинической неврологии в настоящее время весьма сложен. Сложность заключается не только в выборе типа клеток и способа их активации, но еще и в выборе наиболее эффективного и в том числе наиболее безопасного метода введения клеток или стимуляторов их дифференцировки.
В качестве одного из таких способов предлагается периневральное введение НСК в ЦНС. Такое введение позволяет свести травматизацию сохранных нервных клеток к минимуму, а также способствует более естественному проникновению НСК в ЦНС через ГЭБ [5].
Второй из предложенных способов – введение стволовых клеток в рецептивное поле nervi olfactorii. Командой ученых из Беларуси был проведен эксперимент по эндоскопическому введению аутотрансплантата мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в зону иннервации nervi olfactorii, который показал улучшение состояния у пациентов с инсультами и инфарктами головного мозга уже в первые 24 часа после проведения данной терапии в сочетании с классической медикаментозной терапией данной патологии [5].
Возможна доставка суспензированных стволовых клеток путем микроинъекции непосредственно в нервные окончания или трансплантаты. Метод является наиболее простым и в то же время наименее эффективным, так как даже процесс микроинъекции может служить причиной дополнительной травматизации интранейронной архитектуры [19, 47].
Упоминается возможность интраартериального введения стволовых клеток, однако эффективность данного метода не является доказанной [38].
В качестве носителя стволовых клеток можно использовать и нервные проводники, содержащие стимулирующие регенерацию факторы. В частности, новые каркасы, такие как гидрогели, которые имеют трехмерную пористую структуру и хорошую цитосовместимость, и могут быть использованы для обеспечения структурной поддержки клеточной адгезии, пролиферации и роста. Каркасы могут быть разработаны для встраивания биологически активных веществ, таких как NGF [38]. Применение каркасов, например, из полиэтиленгликоля, Матригеля, гиалуроновой кислоты и др. материалов, обеспечивающих межклеточную коммуникацию и пролиферацию клеток, помогает предотвратить нежелательное рассеивание последних из локализации необходимого воздействия [19]. А.В. Балябин и др., проводя трансплантацию аутологичных нейральных стволовых клеток обонятельного эпителия мышей в гидрогеле на основе гиалуроновой кислоты, добились восстановлению рефлекторной активности, а также когнитивных способностей животных с искусственно нанесенной открытой черепно-мозговой травмой [48]. Положительный эффект применения аутогенных обкладочных клеток обонятельного эпителия в препарате «Сферогель» позволяет рекомендовать его для использования в клинике [10].
Доказано, что мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки в альгинатных микрокапсулах теряют свою способность к пролиферации, так же как и ММСК, культивированные в широкопористых альгинатных губках, что А.Ю. Петренко и др. связывают с недостаточными адгезивными свойствами альгината. Присоединение наночастиц желатина к поверхности пор губок способствует увеличению адгезивных свойств носителя (губки) [49].
Заключение
Таким образом, поиск наиболее эффективного и безопасного варианта направленной стимуляции регенерации нервной ткани является перспективной, но тем не менее сложнейшей задачей современной нейротрансплантологии. Несмотря на существование большого количества работ по положительному влиянию трансплантации стволовых клеток для стимуляции регенерации нервной ткани, механизмы их влияния на процессы репарации в настоящее время до конца не установлены. То же самое касается и побочных эффектов применения клеточной терапии. Важным условием успеха является разработка протоколов направленной дифференцировки клеток. В данный момент именно получение клеток с высоким потенциалом к пролиферации и дифференцировке в нервные клетки конкретного фенотипа является наиболее важной целью, достижение которой позволит производить необходимое для проведения клеточной терапии количество специализированных нервных клеток.