набор по флуоресценции для чего

Флуоресцентные красители

В наши дни наблюдается постоянный растущий спрос на сложный многоцветный анализ и поэтому проточная цитометрия предъявляет все более высокие требования к флуорохромам. Компания Miltenyi Biotec разработала семейство флуоресцентных красителей для проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии Vio®, которые превосходят свои аналоги. Семейство Vio® включает в себя: VioBlue®, VioGreen™, VioBright™ FITC, PE-Vio® 615, PE-Vio 770, PerCP-Vio 700, Vio 515, VioBright 515, APC-Vio 770. Данные флюорохромы характеризуются высокой интенсивностью флуоресценции и низкой интенсивностью побочных сигналов, что делает их идеальными флуорохромами для многоцветного анализа. Линейка красителей Vio® в комбинации со стандартными флуорохромами, такими как FITC, PE, PerCP и APC, расширяет портфолио антител Miltenyi Biotec и позволяет подобрать наилучшие сочетания антител для сложного многопараметрического анализа клеток.

VIO ® ФЛУОРОХРОМЫ

К достоинствам флуорохромов Vio можно отнести:

Спектры эмиссии красителей Vio: VioBlue, VioBright 515, Vio 515, VioGreen, VioBright FITC, PE-Vio 615, PerCP-Vio 700, PE-Vio 770, APC-Vio 770

Спецификация флуорохромов

1. ФИОЛЕТОВЫЙ ЛАЗЕР (405 НМ)

1.1 VioBlue® краситель (Em_max452 нм)

VioBlue® краситель – это флуорохром на основе кумарина с длинами волн возбуждения и испускания 400 нм и 455 нм соответственно. Это превосходная альтернатива для таких флуорохромов, как Pacific Blue™, Alexa Fluor® 405 или BD™ Horizon™ V450. Краситель VioBlue очень удобно сочетать с другими флуорохромами, что обеспечивает увеличение числа изучаемых маркеров и их комбинаций в рамках многопараметрического анализа. Флуорохром VioBlue разработан для использования максимального потенциала фиолетовых лазеров на проточных цитометрах, и показывает превосходную производительность по сравнению со многими другими флуорохромами, возбуждаемыми при 405 нм. Такие характеристики, как яркость, отношение сигнал-шум и необходимость компенсации флуоресценции (внутри одного лазера), прекрасно сбалансированы для флуорохрома VioBlue. Кроме того, VioBlue проявляет минимальную фотоиндуцированную деградацию и, следовательно, может быть использован для многих различных применений, таких как флуоресцентная микроскопия.

1.1.1 Общая информация по красителю VioBlue:

1.1.2 Сравнительная таблица аналогов VioBlue (Максимумы поглощения и испускания флуорохромов)

1.1.3 Совместимость c лазерами и фильтрами

С максимумами поглощения и испускания 400 нм и 455 нм соответственно, конъюгаты VioBlue полностью совместимы со стандартными наборами фильтров от всех основных поставщиков оборудования для проточной цитометрии, что дает исследователю гибкость в использовании красителя VioBlue со всеми существующими платформами.

Спектры поглощение (сверху) и испускание (снизу) для VioBlue по сравнению с Pacific Blue, Cascade Blue и Alexa Fluor 405. Синяя граница на спектрах соответствует фильтру 450/50 нм.

1.1.4 Яркость флуорохрома

По сравнению с хорошо зарекомендовавшими себя флуорохромами с высокой интенсивностью флуоресценции, такими как PE, VioBlue проявляет аналогичную степень флуоресценции.

Человеческие мононуклеары периферической крови (PBMS) или мышиные спленоциты (MS) были окрашены: CD20-VioBlue (A; PBMCs), редкий клеточный маркер CD123‑VioBlue (B; PBMCs), CD8-VioBlue (C; PBMCs), или CD90.2-VioBlue (D; MS) и проанализированы методом проточной цитометрии с использованием MACSQuant® Analyzer.

Конъюгаты VioBlue обеспечивают превосходную альтернативу многим спектрально подобным конъюгатам для канала V1, что еще больше увеличивает возможности многоцветного анализа.

Интенсивность флуоресценции клеток, меченых антителами к CD14, конъюгированными с VioBlue или Pacific Blue.

1.1.5 Уменьшенная побочная флуоресценция

Конъюгаты VioBlue обладают минимальной побочной флуоресценцией в канал V2, что делает их прекрасными кандидатами для создания многоцветных панелей антител, подразумевающих использование всех каналов для фиолетового лазера. Более того, VioBlue в очень незначительнй степени возбуждается 488-нм лазером, и поэтому не требует компенсации между каналами V1 и B1.

1.1.6 Высокая стабильность при фиксации

Крайне важно, чтобы конъюгат сохранял свои флуоресцентные свойства после фиксации, чтобы позволить исследователям максимально использовать биологические образцы. Краситель VioBlue обладает очень высокой стабильностью после фиксации с параформальдегидом, равной или превышающей многие другие спектрально подобные флуорохромы.

Окраска CD123-VioBlue до (слева) и после (справа) фиксации с 3.7% парафармальдегидом показывает абсолютно небольшое падение интенсивности флуоресценции после фиксации.

1.2 VioGreen™ краситель (Em_max520 нм)

Краситель VioGreen™ представляет собой флуорохром с большим сдвигом Стокса, излучающий сильную флуоресценцию с длиной волны 520 нм при возбуждении 405 нм. Это небелковый флуорохром со значительно увеличенной средней интенсивностью флуоресценции и более высокими показателями окрашивания по сравнению с родственными флуорохромами, такими как Pacific Orange™, Krome Orange™ и BD Horizon V500. Флуорохром VioGreen разработан для использования максимального потенциала фиолетовых лазеров на проточных цитометрах, и показывает превосходную производительность по сравнению со многими другими флуорохромами, возбуждаемыми при 405 нм. Такие характеристики, как яркость, отношение сигнал-шум и необходимость компенсации флуоресценции (внутри одного лазера), прекрасно сбалансированы для флуорохрома VioGreen. Кроме того, VioGreen проявляет минимальную фотоиндуцированную деградацию и, следовательно, может быть использован для многих различных применений, таких как флуоресцентная микроскопия.

1.2.1 Общая информация по красителю VioGreen:

1.2.2 Максимумы поглощения и испускания флуорохромов — аналогов VioGreen

1.2.3 Совместимость с лазерами и фильтрами

При стандартном наборе фильтров 525/50 нм VioGreen демонстрирует более благоприятный спектральный профиль, чем Pacific Orange или AmCyan.

Спектры поглощения (сверху) и испускания (снизу) для VioGreen, Pacific Orange и AmCyan. Синяя граница на спектрах соответствует фильтру 525/50 нм.

1.2.4 Повышенная яркость

Как и большинство красителей, предназначенных для фиолетового лазера, VioGreen показывает более низкую интенсивность флуоресценции по сравнению с другими хорошо зарекомендовавшими себя флуорохромами, такими как PE. Однако популяции клеток человека и мыши, окрашенные антителом, конъюгированным с VioGreen, можно легко идентифицировать и отличить от неокрашенных клеток.

Человеческие мононуклеары периферической крови (PBMS) или мышиные спленоциты (MS) были окрашены антителами к CD14-VioGreen (A; PBMCs), CD20-VioGreen (B; PBMCs), CD15-VioGreen (C; PBMCs) или CD8a-VioGreen (D; MS) и проанализированы методом проточной цитометрии с использованием MACSQuant Analyzer.

Кроме того, многие конъюгаты VioGreen проявляют более яркую флуоресценцию по сравнению со спектрально подобными конъюгатами, включая Pacific Orange, AmCyan и Horizon V500, измеряемую средней интенсивностью флуоресценции (MFI) или индексом окрашивания (нормализованное отношение сигнал-шум).

Средняя интенсивность флуоресценции и индекс окрашивания для CD8-VioGreen и CD8-Pacific Orange.

Анализ человеческиз PBMCs с использованием CD3 антител, конъюгированных с VioGreen (фиолетовый), Horizon V500 (черный), или Krome Orange (оранжевый).

1.2.5 Высокая стабильность при фиксации параформальдегидом и этанолом

Краситель VioGreen проявляет сильную фотостабильность при фиксации параформальдегидом и этанолом с минимальным фотоиндуцированным разрушением. Это показывает пригодность красителя для использования в исследованиях, требующих фиксации.

Окраска CD14-VioGreen до (слева) и после (справа) фиксации параформальдегидом, показывает очень незначительное уменьшение интенсивности флуоресценции после фиксации.

2 ГОЛУБОЙ ЛАЗЕР (488 НМ)

2.1 VioBright™ 515(Em_max 514 нм)

VioBright™515 — это необычайно яркий краситель для канала FITC. Запатентованная технология мультимеризации позволяет в 4 раза увеличить яркость по сравнению с традиционным красителем FITC. Флуорохром возбуждается синим лазером (488 нм), а пик его излучения приходится на 514 нм. Улучшенная яркость в сочетании с 25% меньшим засветом в канал PE позволяет оптимально обнаруживать редкие поверхностные маркеры в канале FITC.

2.1.1 Общая информация по красителю VioBright 515:

2.1.2 Максимумы поглощения и испускания флуорохромов — аналогов VioBright 515

2.1.3 Совместимость с лазерами и фильтрами

VioBright 515 может быть возбужден синим лазером (488 нм) и показывает пиковое возбуждение и испускание при 488 нм и 514 нм соответственно. Его флуоресцентный сигнал может быть обнаружен с помощью стандартного фильтра для FITC, такого как фильтр 525/50 нм на проточных цитометрах MACSQuant. Таким образом, никакие изменения в фильтрах детекции или в самом проточном цитометре не требуются. С VioBright 515 потенциал наиболее часто используемого фильтра в проточных цитометрах может быть расширен для обнаружения более широкого спектра маркеров, включая редкие и внутриклеточные маркеры.

Спектры поглощения (сверху) и испускания (снизу) для VioBright 515 по сравнению с FITC, VioBright FITC, and Vio 515.

2.1.3 Яркость флуорохрома

VioBright 515-это лучший выбор для обнаружения маркеров с низким уровнем экспрессии. Флуорохром обладает более высокими индексами окрашивания и средней интенсивностью флуоресценции (MFI), чем PE, при этом использование VioBright 515 позволяет получить отличное разрешение положительных и отрицательных популяций клеток.

Человеческие PBMCs были окрашены с помощью антител к CD56, конъюгированных с FITC, VioBright FITC, VioBright 515, или BB515 и проанализированы методом проточной цитометрии с использованием MACSQuant Analyzer 10. VB: VioBright; BB: Brilliant Blue

Средняя интенсивность флуоресценции и индекс окрашивания CD56 антител, конъюгированных с различными флуорохромами

2.1.4 Более высокая специфичность – лучшее разрешение

VioBright 515 является оптимальным красителем для анализа Дим-маркеров, таких как CD56. В приведенном здесь примере популяция клеток CD56+CD3+ NKT из цельной крови может быть проанализирована более точно (правый точечный график), чем с помощью альтернативного яркого красителя для того же канала (левый точечный график).

Человеческая цельная кровь окрашена CD3-VioBlue (клон REA613) и (A) CD56-BB515 или (B) CD56-VioBright 515 (клон REA196).

2.1.5 Высокая стабильность при фиксации

Яркие флуорохромы, такие как PE и APC, часто чувствительны к фиксаторам. Однако для успешного проточного цитометрического анализа внутриклеточных маркеров стабильность конъюгатов флуорохрома при фиксации имеет важное значение. Конъюгаты VioBright 515 демонстрируют превосходную стабильность по отношению к фиксаторам на основе метанола и параформальдегида с небольшим уменьшением в яркости.

Человеческие PBMCs были окрашены с помощью антитела к CD56 (клон REA196), конъюгированного с VioBright 515 или PE. Клетки были проанализированы методом проточной цитометрии до и после фиксации с использованием параформальдегида (PFA) и 90% метанола. Анализ был проведен на MACSQuant Analyzer 10.

Стабильность CD56-VioBright 515 и CD56-PE при фиксации с PFA или метанолом.

2.1.6 Фотостабильность

Стабильность VioBright 515 при воздействии конфокального лазерного излучения была проанализирована в различные моменты времени на конфокальном микроскопе Zeiss LSM710. По сравнению с конъюгатом FITC в эти моменты времени были продемонстрированы значительно более высокие средние интенсивности флуоресценции (MFI) для конъюгированного антитела VioBright 515. Конъюгат VioBright 515 показал фотостабильность, сравнимую с конъюгированным антителом Alexa Fluor 488, что указывает на превосходную пригодность VioBright 515 для иммунофлуоресцентной микроскопии.

Человеческие PBMCs Были окрашены антителами к CD4, конъюгированными с Alexa Fluor 488 (A) и VioBright 515 (B). Окрашенные клетки были зафиксированы параформальдегидом в течение 20 минут и перенесены в 96-луночный планшет для анализа. Сопоставимая фотостабильность может наблюдаться при воздействии конфокального лазерного излучения. Эксперимент проводился на микроскопе Zeiss LSM710.

Человеческие PBMCs были окрашены антителами к CD4, конъюгированными с FITC, Alexa Fluor 488 и VioBright 515. Окрашенные клетки были зафиксированы параформальдегидом в течение 20 минут и перенесены в 96-луночный планшет для анализа. Построенная кривая нормализуется в течение нескольких временных точек.

2.2 VIO®515 (EM_MAX 514 НМ)

Vio ® 515-это органический низкомолекулярный краситель, предназначенный для канала B1/FITC. По сравнению с FITC, Vio 515 показывает улучшенную яркость и позволяет анализировать внутриклеточные маркеры, которые ранее не были доступны для этого канала. Таким образом, краситель обеспечивает большую гибкость в дизайне многоцветных панелей. Vio 515 показывает на 25% меньший засвет в канал PE и облегчает оптимальное обнаружение внутриклеточных маркеров, таких как цитокины и транскрипционные факторы. Краситель возбуждается синим лазером (488 нм), а пик его испускания приходится на 514 нм.

2.2.1 Общая информация по красителю Vio 515:

2.2.2 Максимумы поглощения и испускания флуорохромов — аналогов Vio 515.

2.2.3 Совместимость с лазерами и фильтрами

Vio 515 может быть возбужден синим лазером (488 нм) и показывает пиковое возбуждение и испускание при 488 нм и 514 нм соответственно. Его флуоресцентный сигнал может быть обнаружен с помощью стандартного фильтра для FITC, такого как фильтр 525/50 нм на проточных цитометрах MACSQuant. Таким образом, никакие изменения в фильтрах детекции или в самом проточном цитометре не требуются. С Vio 515 потенциал наиболее часто используемого фильтра в проточных цитометрах может быть расширен для обнаружения более широкого спектра маркеров, включая редкие и внутриклеточные маркеры.

Спектры поглощения (сверху) и испускания (снизу) для Vio 515 по сравнению с FITC, VioBright FITC, и VioBright 515.

2.2.4 Яркость флуорохрома

Vio 515 имеет индексы окрашивания и средней интенсивности флуоресценции (MFI) выше, чем у FITC, поэтому окрашивание с Vio 515 позволяет улучшить разрешение положительных и отрицательных популяций (см. на рисунке ниже).

Человеческие PBMCs были окрашены антителами к CD4 (клон VIT4), конъюгированными с FITC, Vio 515 и Alexa Fluor 488. Образцы были проанализированы методом проточной цитометрии с использованием MACSQuant Analyzer 10.

Средняя интенсивность флуоресценции и индекс окрашивания антител к CD4, конъюгированных с различными флуорохромами.

2.2.5 Более высокая специфичность – лучшее разрешение

Vio 515 является оптимальным флуорохромом для анализа внутриклеточных маркеров, таких как цитокины. На картинке ниже показаны PFA-фиксированные человеческие PBMCs, которые были окрашены антителом против IL-5-Vio 515, что позволило обнаружить субпопуляцию CD4+CD69+ Т-клеток, экспрессирующих IL-5.

Человеческие мононуклеары периферической крови (PBMCs) нестимулированные (A) или стимулированные (B) PMA/Иономицин в течение 6 часов. После двух часов был добавлен Брефельдин А. Клетки были зафиксированы, пермеабилизированы, и окрашены внутриклеточно с Anti-IL-5 антителом. Клетки проанализированы методом проточной цитометрии. Гистограмма плотности показывает CD4 + лимфоциты выделенные по CD4-APC.

2.2.6 Фотостабильность

Стабильность Vio 515 при воздействии конфокального лазерного излучения была проанализирована в различные моменты времени на конфокальном микроскопе Zeiss LSM710. Vio 515 демонстрирует фотостабильность, сравнимую с Alexa Fluor 488, что указывает на превосходную пригодность для иммунофлуоресцентной микроскопии.

Человеческие PBMCs были окрашены антителами к CD4, конъюгированными с Alexa Fluor 488 (A) Vio 515 (B). Окрашенные клетки были зафиксированы параформальдегидом в течение 20 минут и перенесены в 96-луночный планшет для анализа. Сопоставимая фотостабильность может наблюдаться при воздействии конфокального лазерного излучения. Эксперимент проводился на микроскопе Zeiss LSM710.

Vio 515 показал значительно более высокую среднюю интенсивность флуоресценции (MFI), чем FITC в различные моменты времени.

Фотостабильность
Человеческие PBMCs были окрашены несколькими антителами к CD4, конъюгированными с различными флуорохромами. Окрашенные клетки были зафиксированы параформальдегидом в течение 20 минут и перенесены в лунки 96-луночного планшета для анализа. Построенная кривая нормализуется в течение нескольких временных точек.

2.4 VioBright™ FITC (Em_max522 нм)

VioBright ™ FITC возбуждается синим лазером (488 нм). Технология VioBright позволяет увеличить количество конъюгированных молекул FITC на одно антитело по сравнению с обычной конъюгацией FITC. Обладая яркостью, сходной с PE, VioBright FITC расширяет возможности многоцветной проточной цитометрии. Кроме того, он является яркую альтернативой для обнаружения редких клеток, а также тусклых и нехарактеризованных маркеров.

2.4.1 Общая информация по красителю VioBright FITC:

2.4.2 Максимумы поглощения и испускания флуорохромов — аналогов VioBright FITC

2.4.3 Совместимость с лазерами и фильтрами

При возбуждении синим лазером (488 нм) VioBright FITC показывает пиковое поглощение и испускание при 496 нм и 522 нм соответственно. Его высокоинтенсивный флуоресцентный сигнал может быть обнаружен с помощью стандартного фильтра FITC, такого как фильтр 525/50 нм на MACSQuant проточных цитометрах. Таким образом, никакие изменения в фильтрах обнаружения или самом проточном цитометре не требуются для использования VioBright FITC вместо FITC или других родственных флуорохромов. Наряду с PE, VioBright FITC увеличивает потенциал синего лазера, одного из наиболее распространенных лазеров, доступных для одно — или многолазерных приборов.

Совместимость лазера и фильтра
Спектры поглощения (сверху) и испускания (снизу) для VioBright FITC по сравнению с FITC, Alexa Fluor 488 и BD Horizon Brilliant Blue 515 (BB515).

2.4.4 Повышенная яркость

VioBright FITC-это превосходный выбор для обнаружения маркеров с низким уровнем экспрессии. С индексом окрашивания и средней интенсивностью флуоресценции, сопоставимыми с PE, окрашивание VioBright FITC позволяет получить отличное разрешение положительных и отрицательных популяций клеток.

Обнаружение CD25 + клеток с использованием VioBright FITC конъюгата.

Обнаружение CD335 + клеток с использованием VioBright FITC конъюгата.

Надежный анализ редких типов клеток требует специфической идентификации клеточных субпопуляций с низкими встречаемостью и четкого разделения целевой популяции клеток. Таким образом, высокоспецифичные антитела вместе с яркими конъюгатами необходимы для выявления редких клеточных популяций. VioBright FITС — это исключительно яркий краситель для оптимального определения субпопуляций клеток и их детального фенотипического анализа.

Обнаружение CD133/1 + клеток с использованием VioBright FITCконъюгата.

MFI и индекс окрашивания CD25 (клон 4E3), CD335 (клон 9E2) и CD133/1 (клон AC133) антител, конъюгированных с VioBright FITC или PE.

2.4.5 Засвет в другие каналы

По сравнения со стандартным FITC, VioBright FITC показывает незначительное увеличение величины засвета в соседний канал PE. Таким образом, при минимальном изменении параметров компенсации VioBright FITC обеспечивает преимущество более яркого красителя.

2.5 PE-Vio® 615 (Em_max619 нм)

PE-Vio ® 615-это тандемный краситель с PE в качестве донора и Vio 615 в качестве акцепторного красителя. PE-Vio 615 оптимизирован для эффективной передачи энергии от донора к акцептору, высокой интенсивности флуоресценции и низкого засвета в канал детекции донорного красителя. PE-Vio 615 разработан, как альтернатива красителям ECD, PE-Texas Red, PE-eFluor 610, PE-CF594, and PE/Dazzle 594. Данный тандемный краситель расширяет возможности многоцветной проточной цитометрии при работе с редкими клеточными популяциями клеток.

2.5.1 Общая информация по красителю PE—Vio 615:

2.5.2 Совместимость с лазерами и фильтрами

Молекула PE показывает пиковое поглощение на двух длинах волн, 496 нм и 565 нм. Это позволяет оптимально возбуждать PE-содержащие тандемные красители, такие как PE-Vio 615, синими, зелеными и желтыми лазерами (488-561 нм). Поглощение при 565 нм больше, чем при 496 нм. Поэтому максимальное возбуждение PE-Vio 615 достигается с помощью таких приборов, как MACSQuant VYB, в котором установлен желтый лазер для возбуждения PE и PE-содержащих тандемных красителей. Сигнал испускания может быть обнаружен с помощью типичных фильтров, предназначенных для PE-Texas Red, таких как фильтр 615/20 нм.

Absorption (A) and emission (B) spectra of PE-Vio 615.

Человеческие PBMCs были окрашены антителами к CD4 (clone VIT4), конъюгированными с PE-Vio 615 и проанализированы на приборах MACSQuant VYB (A) и MACSQuant Analyzer (B).

2.5.3 Яркость флуорохрома

PE-Vio 615 разработан как яркая альтернатива таким красителям, как PE-eFluor 610, PE-CF594, ECD, и PE/Dazzle 594.

Человеческие PBMCs были окрашены антителами к CD4, конъюгированными с PE-eFluor 610, PE-CF594, PE-Vio 615, ECD, и PE-Dazzle 594 и проанализированы методом проточной цитометрии на MACSQuant VYB.

MFI и индексы окрашивания для антител к CD4, конъюгированных с PE-Vio 615, ECD, PE-CF594, PE-eFluor 610, и PE/Dazzle 594.

PE-Vio 615 обеспечивает высокую интенсивность флуоресценции и показатели окрашивания, что позволяет отлично разделять положительные и отрицательные популяции клеток. Это делает PE-Vio 615 оптимальным красителем для анализа тусклых маркеров и маркеров, которые трудно охарактеризовать.

Человеческие PBMCs были окрашены антителами к CD56 (клон REA196), конъюгированными с PE-Vio 615 или PE. Клетки были также окрашены антителом CD335-VioBright FITC и затем проанализированы на проточном цитометре MACSQuant VYB.

PBMCs were stimulated for 6 hours. After 2 hours, 1 μg/mL BrefeldinA was added for the remaining 4 hours. Cells were stained extracellularly with CD4-FITC, fixed, permeabilized with the Inside Stain Kit (Miltenyi Biotec), and stained intracellularly with CD154-VioBlue and Anti-IL-4-PE or Anti-IL-4-PE-Vio 615 (clone: 7A3-3) for subsequent flow cytometry analysis. Cells were gated on CD4 + lymphocytes. Numbers indicate cell frequencies among CD4 + cells. Data courtesy of Petra Bacher, Clinic for Rheumatology and Clinical Immunology, Charité – University Medicine Berlin, Berlin, Germany.

2.5.5 Высокая стабильность при фиксации

Тандемные конъюгаты часто чувствительны к фиксаторам. Однако для многих экспериментов, требующих предварительной фиксации, стабильность тандемных конъюгатов имеет решающее значение. PE-Vio 615 показывает превосходную стабильность к фиксации параформальдегидом без какого-либо увеличения фонового сигнала.

Человеческие PBMCs были окрашены антителами к CD56 (клон REA196), конъюгированными с PE, PE-Vio 615 или PE-Dazzle 594. Дополнительно, клетки были окрашены антителами к CD335-VioBright FITC и проанализированы до и после фиксации параформальдегидом. Окрашенные клетки проанализированы на проточном цитофлуориметре.

2.5.6 Фотостабильность

Стабильность PE-Vio 615 при воздействии окружающего света была проанализирована в различные моменты времени. PE-Vio 615 показал значительно более высокие средние интенсивности флуоресценции (MFI) и индексы окрашивания в эти моменты времени, чем коммерчески доступные альтернативы.

Человеческие PBMCs были окрашены антителами к CD56, конъюгированными с PE-Vio 615 (клон REA196) или PE-Dazzle 594 (клон HCD56). Затем окрашенные клетки были подвергнуты воздействию окружающего света (

850 Lux) и проанализированы в разные моменты времени методом проточной цитометрии с использованием MACSQuant VYB. Завсвет в канал Y1, который оптимизирован для обнаружения сигнала PE, также был проанализирован после воздействия света.

2.6 PerCP-Vio® 700 (Em_max704 нм)

PerCP-Vio ® 700-это тандемный конъюгат, который объединяет белок хлорофилла перидинина (PerCP) и краситель Vio 700. Эмиссии флуоресценции наблюдается при 655-730 нм при возбуждении синим лазером 488 нм. Этот краситель идеально подходит для канала B3 анализатора MACSQuant.

2.6.1 Общая информация по красителю PerCP-Vio 700:

2.6.2 Максимумы поглощения и испускания для флуорохромов-аналогов PerCP-Vio 700

2.6.3 Совместимость с лазерами и фильтрами

PerCP-Vio 700 демонстрирует очень узкий профиль спектра излучения при использовании в комбинации со стандартным полосовым фильтром 655-730 нм, что позволяет улавливать и удерживать большую часть света.

Спектры поглощения и испускания для PerCP-Vio 700. Синяя граница на спектрах соответствует фильтру 655–730 нм.

2.6.4 Яркость флуорохрома

Человеческие мононуклеары периферической крови и мышиные спленоциты были окрашены различными антителами, конъюгированными с PerCP-Vio 700. По результатам цитометрического анализа наблюдалось отличное различие между положительными и отрицательными популяциями клеток для различных специфических антител.

Человеческие мононуклеары периферической крови (PBMCs) или мышиные спленоциты (MS) были окрашены следующими антителами: CD20-PerCP-Vio 700 (A; PBMCs), CD4-PerCP-Vio 700 (B; PBMCs), CD45-PerCP-Vio 700 (C; PBMCs) или CD90.2-PerCP-Vio 700 (D; MS) и проанализированы методом проточной цитометрии на MACSQuant Analyzer.

2.6.5 Высокая стабильность при фиксации

PerCP-Vio 700 показывает превосходную стабильность по отношению к фиксаторам, с минимальным снижением флуоресценции после фиксации.

CD8-PerCP-Vio 700 до (A) и после (B) инкубации с 3.7% параформальдегидом, показывает минимальное снижение флуоресценции после фиксации.

2.6.6 Фотостабильность

Анализ фотостабильности CD14-PerCP-Vio 700 показал отсутствие заметных изменений после четырехчасового непрерывного воздействия окружающего света (

850 люкс). PerCP-Vio 700 показал значительно более высокие средние интенсивности флуоресценции (MFI) и индексы окрашивания в этот период времени, чем коммерчески доступные альтернативы.

Конъюгаты антител PerCP, PerCP‑Vio 700, и PerCP-Cy 5.5 были оставлены под воздействием окружающего света на 4 часа, и показали прекрасную фотостабильность.

2.7 PE-Vio® 770 (Em_max 770нм)

PE-Vio ® 770 — это тандемный конъюгат, подобный PE-Cy7, который работает по принципу резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET), допускающего большие Стоксовые сдвиги между поглощенной энергией донора флуоресценции (PE) и длиной волны излучения подходящего акцепторного красителя (Vio 770).

2.7.1 Общая информация по красителю PE-Vio 770:

2.7.2 Максимумы поглощения и испускания PE-Vio 770

2.7.3 Совместимость с лазерами и фильтрами

Тандемные красители PE-Vio 770, PE-Cy7 и PE-Alexa Fluor 750 используют PE в качестве донорной молекулы, демонстрируя поглощение при 495 пм и, в большей степени, при 567 нм. Таким образом, MACSQuant VYB, оснащенный желтым лазером c длиной волны 561 нм, лучше всего подходит для обеспечения максимального возбуждения молекул PE, которые, в свою очередь, передают энергию соответствующей молекуле акцептора. Vio 770 обладает эмиссионными свойствами, аналогичными с Cy7 и Alexa Fluor 750.

Спектры поглощения и испускания для PE-Vio 770.

2.7.4 Яркость флуорохрома

PE-Vio 770 обеспечивает прекрасную интенсивность флуоресценции, как и все семейство флуорохромов Vio, и оптимальное разделение позитивных и негативных клеточных популяций.

Человеческие мононуклеары периферической крови (PBMC) или мышиные спленоциты (MS) были окрашены антителами к CD3-PE-Vio 770 (A; PBMCs), CD14-PE-Vio 770 (B; PBMCs), CD19-PE-Vio 770 (C; PBMCs), или CD4-Biotin/Anti-Biotin-PE-Vio 770 (D; MS) и проанализированы методом проточной цитометрии на MACSQuant Analyzer.

По сравнению с другими спектрально подобными тандемными конъюгатами, такими как PE-Cy7 или PE-Alexa Fluor 750, PE-Vio 770 демонстрирует значительно более высокие средние интенсивности флуоресценции (MFI) и индексы окрашивания и требует меньшей компенсации. Эти свойства делают PE-Vio 770 превосходным тандемным конъюгатом по сравнению с PE-Cy7 или PE-Alexa Fluor 750.

Анализ человеческих PBMCs, с использованием антитела к CD8 (клон BW135/80), конъюгированного с PE-Vio 770 или PE-Cy7. Было проведено одновременное окрашивание антителами к CD14-PerCP и CD56-PE для исключения CD14 + и CD56 + клеток из анализа.

MFI, индекс окрашивания, и компенсация, необходимая для CD8-PE-Vio 770 и CD8-PE-Cy7.

2.7.5 Высокая стабильность при фиксации

Тандемные конъюгаты обычно менее стабильны после фиксации, чем одиночные флуорохромы. Однако, как показано ниже, PE-Vio 770 демонстрирует превосходную стабильность,

CD45RA-PE-Vio 770 флуоресценция до (A) и после (B) фиксации параформальдегидом. Величины MFIs с фиксацией и без фиксации составляют 124 и 139, соответственно, что говорит о снижении интенсивности флуоресценции всего лишь на 11% после фиксации.

3 Желтый лазер (561 nm)

3.1 Флуорохром PE—Vio®615 (Em_max 619 nm)

PE-Vio ® 615-это тандемный краситель с PE в качестве донора и Vio 615 в качестве акцепторного красителя. PE-Vio 615 оптимизирован для эффективной передачи энергии от донора к акцептору, высокой интенсивности флуоресценции и низкого засвета в канал обнаружения донорного красителя. PE-Vio® 615 разработан как превосходная альтернатива таким флуорохромам, как ECD, PE-Texas Red, PE-eFluor 610, PE-CF594 и PE/Dazzle 594. Данный конъюгат расширяет возможности гибкого многоцветного дизайна панелей антител и обеспечивает яркий сигнал для уверенной работы с тусклыми и редкими маркерами.

3.1.1 Общая информация по красителю PE-Vio 615:

3.1.2 Максимумы поглощения и испускания для PE-Vio

3.1.3 Совместимость с лазерами и фильтрами

Молекула PE показывает пиковое поглощение на двух длинах волн, 496 нм и 565 нм. Это позволяет оптимально возбуждать PE-содержащие тандемные красители, такие как PE-Vio 615, синим, зеленым и желтым лазерами (488-561 нм). Поглощение при 565 нм больше, чем при 496 нм. Поэтому максимальное возбуждение PE-Vio 615 достигается с помощью таких приборов, как, например, MACSQuant VYB, в котором установлен желтый лазер для оптимального возбуждения PE и PE-содержащих тандемных красителей. Сигнал испускания может быть обнаружен с помощью типичных фильтров, разработанных для PE-Texas Red, таких как фильтр 615/20 нм.

Спектры поглощения (A) и испускания (B) для флуорохрома PE-Vio 615 и спектрально подобных флуорохромов.

Человеческие PBMCs окрашены антителами к CD4 (клон VIT4), конъюгированными с PE-Vio 615 и проанализированы на MACSQuant VYB (A) и MACSQuant Analyzer (B).

3.1.4 Яркость флуорохрома

PE-Vio 615 разработан, как более яркая альтернатива таким красителям, как PE-eFluor 610, PE-CF594, ECD и PE/Dazzle 594.

Человеческие PBMCs окрашены антителами к CD4, конъюгированными с PE-eFluor 610, PE-CF594, PE-Vio 615, ECD, и PE-Dazzle 594 и проанализированы с использованием проточного цитометра MACSQuant VYB.

MFI и индексы окрашивания антител к CD4, конъюгированных с флуорохромами PE-Vio 615, ECD, PE-CF594, PE-eFluor 610, и PE/Dazzle 594.

PE-Vio 615 обеспечивает высокую интенсивность флуоресценции и индекс окрашивания, что дает возможность различать положительные и отрицательные популяции клеток. PE-Vio 615 является оптимальным красителем для анализа тусклых маркеров и маркеров, которые трудно охарактеризовать.

Человеческие PBMCs окрашены антителами к CD56 (клон REA196), конъюгированными с PE-Vio 615 или PE. Клетки также были окрашены антителами CD335-VioBright FITC и проанализированы на проточном цитометре MACSQuant VYB.

3.1.5 Высокая стабильность при фиксации

Тандемные конъюгаты часто чувствительны к различным фиксаторам. Однако для некоторых видов анализа, требующих предварительной фиксации, стабильность тандемных конъюгатов имеет решающее значение. PE-Vio 615 показывает превосходную стабильность к фиксации параформальдегидом без какого-либо увеличения фонового сигнала.

Человеческие PBMCs окрашены антителами к CD56 (клон REA196), конъюгированными с PE, PE-Vio 615, или PE-Dazzle 594. Клекти дополнительно были окрашены антителами к CD335-VioBright FITC и проанализированы методом проточной цитометрии до и после фиксации параформальдегидом.

3.1.6 Фотостабильность

Стабильность PE-Vio 615 при воздействии окружающего света была проанализирована в различные моменты времени. PE-Vio 615 показал значительно более высокие средние интенсивности флуоресценции (MFI) и индексы окрашивания в эти моменты времени, чем коммерчески доступные альтернативы.

Человеческие PBMCs окрашены антителами к CD56, конъюгированными с PE-Vio 615 (клон REA196) или PE-Dazzle 594 (клон HCD56). Окрашенные клетки подвергались воздействию оеружающего света (

850 lux) и затем проанализированы в разные моменты времени методом проточной цитометрии с использованием MACSQuant VYB. Засвет в Y1 канал, который оптимизирован для детекции сигнала флуорохрома PE, был также оценен.

4 Красный лазер (635 нм)

4.1 Флуорохром APC-Vio® 770(Em_max 770 нм)

Краситель APC-Vio ®770 представляет собой тандемный конъюгат, подобный APC-Cy7 или APC-H7, который работает по принципу резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET), допускающего большие Стоксовые сдвиги между поглощенной энергией донора флуоресценции (APC) и длиной волны излучения подходящего акцептора (Vio 770).

4.1.1 Общая информация APC-Vio 770:

4.1.2 Максимумы поглощения и испускания для APC-Vio

4.1.3 Совместимость лазеров и фильтров

Тандемные красители APC-Vio 770, APC-Cy7 и APC-H7 используют APC в качестве донорного флуорохрома, демонстрируя максимальное поглощение около 652 нм. Спектры испускания для Vio 770, Cy7, H7 и Alexa Fluor 750 аналогичны. Поэтому APC-Vio 770 является идеальным тандемным конъюгатом для этого канала во всех проточных цитометрах.

Спектры поглощения и испускания для APC-Vio 770.

4.1.4 Повышенная яркость

APC-Vio 770 обеспечивает яркое окрашивание, позволяющее идентифицировать и анализировать специфические клеточные популяции.
Яркое окрашивание с помощью конъюгата с APC-Vio 770 проиллюстрировано по отношению к неокрашенным клеткам (слева), окрашивание с CD16-APC (по середине), и окрашивание с CD16-APC-Vio 770 (справа). Результаты продемонстрированы на клеточной суспензии после гейтирования по лейкоцитам и удаления мертвых клеток.

По сравнению с другими спектрально подобными конъюгатами, такими как APC-Cy7 и APC-H7, APC-Vio 770 демонстрирует равные или более сильные паттерны окрашивания. Кроме того, APC-Vio 770 показывает более высокие средние интенсивности флуоресценции (MFI) и большие значения Индекса окрашивания, а также требует меньшей компенсации по каналу R1, чем APC-Cy7 и APC-H7. Эти свойства делают APC-Vio 770 идеальным флуорохромом для использования в канале R2.

Анализ человеческих PBMCs с использованием антител к CD8 (клон BW135/80) Конъюгированных с APC-Vio 770, APC-Cy7, или APC-H7. Одновременное окрашивание CD14-PerCP и CD56-PE проводили для исключения CD14+ и CD56+ клеток из анализа.

MFI, индексы окрашивания, и компенсация, требующаяся для CD8-APC-Vio 770, CD8-APC-Cy7, и CD8-APC-H7.

4.1.5 Высокая стабильность при фиксации

APC-Vio 770 показывает прекрасную стабильность после фиксации параформальдегидом, схожую с флуорохромом PE-Vio 770.

Клетки окрашены антителом к CD45-APC-Vio 770, слева живые клетки (слева) или фиксированные параформальдегидом (справа). MFI с фиксацией и без фиксации равны 62 и 68, соответственно, что свидетельствует о снижении интенсивности флуоресценции всего лишь на 8% после фиксации.

Источник