на чем основан метод гель фильтрации
Гель-фильтрация
Полезное
Смотреть что такое «Гель-фильтрация» в других словарях:
гель-фильтрация — гель хроматография Один из видов хроматографии [http://www.dunwoodypress.com/148/PDF/Biotech Eng Rus.pdf] Тематики биотехнологии Синонимы гель хроматография EN gel filtration … Справочник технического переводчика
гель-фильтрация — гель фильтрация, гель фильтрации … Орфографический словарь-справочник
Гель-фильтрация — метод очистки и концентрации вирусов, основанный на разной скорости перемещения в геле вирусов с разными размерами. (Источник: «Словарь терминов микробиологии») … Словарь микробиологии
гель-фильтрация — gelchromatografija statusas T sritis Standartizacija ir metrologija apibrėžtis Chromatografija, kai molekulėms išskirstyti pagal matmenis vartojamas akytas polimero gelis. atitikmenys: angl. gel chromatography; gel filtration; gel permeation… … Penkiakalbis aiškinamasis metrologijos terminų žodynas
гель-фильтрация — gelchromatografija statusas T sritis chemija apibrėžtis Chromatografija, kai molekulėms išskirstyti pagal matmenis naudojamas akytas polimero gelis. atitikmenys: angl. gel chromatography; gel filtration; gel permeation chromatography rus. гель… … Chemijos terminų aiškinamasis žodynas
гель-фильтрация — гель фильтра/ция, гель фильтра/ции … Слитно. Раздельно. Через дефис.
гель-фильтрация — см. Гель хроматография … Большой медицинский словарь
ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ — см. Эксклюзионная хроматография … Химическая энциклопедия
Гель фильтрация — … Википедия
Гель-фильтрация — прием, позволяющий разделить гуминовые кислоты и фульвокислоты на несколько фракций и приближенно оценить размеры средних молекулярных весов … Толковый словарь по почвоведению
Конспект по химии «Гель-фильтрация»
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ОБЛАСТНОЙ УНИВЕРСИТЕТ
по «Методам биохимических исследований»
тема «Гель-фильтрация. Общая характеристика метода. Очистка и фракционирование макромолекул методом гель-фильтрации. Определение молекулярной массы. Области применения гель-фильтрации.»
очной формы обучения
Гирич Галина Александровна
Разделение молекул по размерам и форме основано на свойствах молекулярного сита , которыми обладают многие пористые материалы.
Гель-фильтрацию открыли в 1959 Д. Порат и П. Флодин, которые показали возможность фракционирования водорастворимых макромолекул, в т. ч. белков, по молекулярной массе, в качестве сита они использовали сшитый декстрановый гель. В 1964 Д. Мур предложил с помощью гель-проникающей хроматографии определять молекулярную массу полимеров, фракционируя их на стирол-дивинилбензольном геле.
Принцип, лежащий в основе метода проникающей хроматографии, прост. Хроматографическую колонку заполняют набухшим гелем или
пористыми стеклянными шариками и уравновешивают с помощью соответствующего растворителя. Крупные молекулы, не проникающие в поры сита, проходят между частицами геля, в то время как небольшие молекулы «застревают» в них и движутся с меньшей скоростью.
Для гель-фильтрации применяют гели на основе декстрана (сефадекс), полиакриламида (акрилекс, биогель Р), агарозы (сефароза, биогель А, сагавак), полиакрилоилморфина (энзокрилгель), полистиролов (Био-Бидз S).
Гель образует неподвижную фазу, в которой с током буфера происходит разделение биологических молекул. Гель формируют в колонках, чаще стеклянных, различного размера и диаметра (в зависимости от цели эксперимента). Гель-хроматография на сефадексе используется для обессоливания растворов белков (разделение крупных белковых молекул и малых молекул солей), определения молекулярных масс белков, разделения сложных смесей макромолекул. Размер биологических молекул является главным фактором их эффективного разделения при движении в пористом геле. Гели, используемые для хроматографии, имеют разный размер пор, что позволяет делить вещества в широком диапазоне молекулярных масс ( 1000 — 1000000 дальтон). При прохождении через колонку геля смеси молекул разного размера крупные молекулы движутся быстрее, чем мелкие, так как последние за счет проникновения в пористые гранулы геля проходят более длинный путь. В конечном итоге компоненты смеси элюируются с колонки, наполненной гранулами геля,в порядке уменьшения их молекулярной массы. Для характеристики процесса гель-фильтрации используют понятия: свободный объем колонки ( Vo ) и объем элюции ( Ve ). Свободный объем определяют путем пропускания через колонку раствора « голубого декстрана » (высокомолекулярного вещества с массой 2 х 10 6 дальтон). Объем, с которым выходит пиковая концентрация голубого декстрана, называется свободным объемом колонки ( V o ). Объем, с которым выходит пиковая концентрация разделяемого вещества, называется объемом элюции ( V e ).
В этом простейшем варианте хроматографии молекулы фракционируемых веществ не должны обладать никаким специальным сродством к неподвижной или подвижной фазам. Неподвижная фаза здесь представлена жидкостью, находящейся внутри пористых гранул,— точно такой же, как и жидкость подвижной фазы, протекающей между ними. Благодаря силам сцепления с поверхностью пространственной сетки полимера или иного пористого материала, образующего гранулы, жидкость внутри них остается неподвижной и не увлекается течением подвижной фазы. В подавляющем большинстве случаев применения гель-фильтрации для биологических целей рабочей жидкостью служат водно-солевые растворы, а материалы гранул гидрофильны. Переход молекул вещества из подвижной фазы в неподвижную и обратно за счет диффузии ничем не затруднен. Иная ситуация складывается внутри гранул. Здесь диффузия более или менее затруднена из-за столкновений молекул диффундирующего вещества с нитями пространственной сетки полимера или стенками пор. Если размеры молекул соизмеримы со средним диаметром каналов в гранулах, то эти затруднения становятся весьма существенными и диффузия тормозится.
Может сложиться и такое положение, когда часть внутреннего объема гранул, т. е. часть объема неподвижной фазы (а иногда и весь этот объем), оказывается недоступной для молекул вещества, растворенного в подвижной фазе.
Различие степени доступности объема неподвижной фазы для молекул различных компонентов исходной смеси веществ является фактором, определяющим возможность их фракционирования. Очевидно, что оно будет происходить по размерам молекул (рис. 1). Если в составе смеси имеются очень крупные молекулы, вовсе не проникающие внутрь гранул, то они будут выходить из колонки или достигать края хроматографической пластины вместе с передним фронтом подвижной фазы («фронтом элюции»). В то же время мелкие молекулы, свободно диффундирующие внутрь гранул, часть времени будут находиться в неподвижной фазе. Статистически эта часть времени одинакова для всех молекул такого размера и зависит от соотношения объемов жидкости в неподвижной и подвижной фазах. Таким образом, все мелкие молекулы достигнут конца хроматографического пути более или менее одновременно и заведомо позднее, чем крупные. Молекулы промежуточных размеров, для которых из-за разброса значений эффективных диаметров пор внутри гранул неподвижной фазы доступна только часть ее объема, должны, очевидно, перемещаться вдоль колонки или пластины с промежуточной скоростью.
Это явление первоначально было названо «гель-фильтрацией», поскольку в качестве пространственной сетки использовали полимерные гели. Однако эти гели относительно легко деформируются и для хроматографии при высоком давлении непригодны, поэтому их стали заменять жесткими материалами, в частности пористым стеклом и силикагелем. Иногда для этого варианта хроматографии вводят термин «эксклюзивная хроматография» («exclusion» — исключение; имеется в виду исключение из гранул крупных молекул). Поскольку сейчас силикагель явно вытесняет пористое стекло, мы сохраним для рассматриваемого варианта хроматографии прежнее название — гель-фильтрация.
Очевидно, что размеры молекул связаны с их массами, но отнюдь не целиком ими определяются. Это особенно важно учитывать в случае макромолекул, размеры которых могут существенно зависеть от плотности упаковки полипептидной или полинуклеотидной цепи. В ограничении свободы диффузии через пространственную сетку пор внутри гранул немалую роль может играть и форма молекулы. Очевидно, что сферическая глобула будет диффундировать иначе, чем молекула такого же объема, но вытянутая в виде палочки.
Как во всех хроматографических разделениях излишняя длина колонки приводит к размыванию пика (Рис. 2).
Рис. 2. Уширение полос в колон ке из-за чрезмерной длины колон ки. Так называемая эффективная часть колонки является достаточной для разделения. Слишком длинные колонки не улучшают очистку, но вызывают разбавление образца из- за уширения полос.
Гель-фильтрационная хроматография является методом для оценки молекулярной массы молекул. Г ель-фильтрация также ока зывается полезной для измерения равновесий мономер-мультимер при микромолярных (мкМ) концентрациях биомолекул (Рис. 3).
Рис.3. Молекулы с известной молекулярной массой дают возможность оценить молекулярную массу неизвестной молекулы. В данном случае для исследуемой молекулы наблюдаются два пика, что указывает на равновесие мономер-димер.
Пористые материалы для гель-фильтрации чаще всего выпускаются в виде сферических гранул целого набора диаметров с различными средними размерами пор.
Гели на основе декстрана (сефадексы )
Декстран также представляет собой полисахарид — в основном линейный полимер на основе глюкозы, где звенья связаны β-1,6-глюкозидной связью
Рис.2. Химическая форма декстрана.
Это тоже полиатомный спирт с высокой степенью гидрофильности, предоставляющий столь же широкие, как и целлюлоза, возможности для модификации и также химически инертный. Устойчивость к действию кислот у декстрана еще меньше, чем у целлюлозы. Его не следует обрабатывать более крепким раствором, чем 0,1 н. НС1 (в течение 2 ч). К щелочи гели на основе декстрана более устойчивы: они сохраняют свои свойства в 0,25 н. NaOH до 2 мес даже при температуре 60оС. Рабочий диапазон рН составляет 2-12. Существенное отличие от целлюлозы состоит в том, что нити декстрина не образуют агрегатов, так как они не вполне линейны — имеются достаточно многочисленные ветвления (по связям 1.2-, 1,3- и 1,4-).
Химическая форма сефадекса.
В гелях для хроматографии («сефадексах») нити декстрана химически сшиты эпихлоргидрином. Однако сшивка не очень жесткая: сефадексы относительно мягки и легко сжимаются, а в водных растворах сильно набухают. Утери качества выражены тем сильнее, чем меньше процентное содержание эпихлоргидрина. Изменяя долю сшивки, можно регулировать средний размер пор, образуемых пространственной сеткой сшитого геля. Ввиду статистического распределения сшивок по объему геля разброс размеров пор невелик, и сефадексы заметно более гомогенны, а свойства их лучше воспроизводимы, чем у целлюлозы. 
Они «не боятся» высушивания и при замачивании не требуют никакой специальной обработки. Сефадексы можно автоклавировать как в сухом, так и во влажном виде в нейтральной среде при 120 о С в течение 30 мин. Суспензию сефадекса (набитую колонку) следует хранить с антисептиком, так как он, подобно целлюлозэ, легко атакуется микроорганизмами. Сефадексам присуща некоторая адсорбционная способность по отношению к ароматическим и гетероциклическим молекулам, которую даже удается использовать для фракционирования нуклеиновых оснований,ароматических аминокислот и пептидов. Кроме того, продажные сефадексы содержат в своей структуре небольшое количество карбоксильных групп, что придает им некоторое сродство к катионам. При хроматографии его легко подавить введением в элюент соли ( NaCl ) в концентрации около 0,02 М.
Мягкость сефадексов (особенно слабосшитых) накладывает ограничения на допустимые значения скоростей хроматографическон элюцпи, которые подробно рассмотрены ниже. По этой же причине определенные сложности возникают при использовании ионообмеиников па основе сефадексов: за счет сил электростатического отталкивания своих ионогенных групп они склонны деформироваться при изменении ионной силы элюента. Все это привело к разработке в последние годы ряда более жестких матриц, вытесняющих сефадексы из традиционных областей их применения — гель-фильтрации и ионообменной хроматографии.
Положение усугубляется тем, что внутри плотно упакованных пучков нитей гидроксильные группы недоступны для модификации. В условиях хроматографии агароза химически неактивна, но уязвима для действия кислот, щелочей и окислителей. Рабочий диапазон рН при использовании матриц из обычной агарозы лежит в пределах 4-9. Агароза выдерживает непродолжительный контакт с 8 М мочевиной и 6 М гуанидиихлоридом, которые все же постепенно ее разрушают.Поскольку агароза для хроматографии представляет собой водный гель, о набухании ее говорить не приходится. Но следует помнить о том, что агарозу нельзя сушить ввиду необратимой деструкции геля. Агароза для хроматографии поставляется в виде суспендированных в воде сферических гранул диаметром 60— 200 мкм, которые в таком виде и следует хранить. При кратковременном обсыхании колонки, заполненной агарозой, пока гранулы не начали терять находящуюся в них жидкость, хроматографнческне характеристики сорбента еще могут быть восстановлены. Если же подсыхание гранул началось, то гель приходится выбрасывать (разумеется, его можно расплавить и использовать, например, для электрофореза, но гранулированная структура будет уже утрачена). Размер пор (пустот) в гранулах зависит от процентного содержания агарозьг в геле (2, 4 или 6%). Связанные с агарозой остатки сульфокислоты (до 0,5% по массе) могут сорбировать щелочные белки. Эта сорбция подавляется в присутствии 0,02 М NaC l или другой соли. Гранулированную агарозу для гель-фильтрации и синтеза аффинных сорбентов выпускают следующие фирмы: «Pharmacia» — под торговым названием «Sepharose», «Bio-Rad» — под названием «Bio-Gel A», «LKB» (Швеция) и «IBF» (Франция) — под названием «Ultrogel А».
Для повышения химической и термической стойкости матриц фирма «Pharmacia» разработала вариант гелей агарозы, в которых нити полимера дополнительно химически «сшиты» обработкой 2,3-дибромпропанолом в сильно щелочной среде. Матрицы на основе такой «сшитой» агарозы носят общее наименование «Sepharose CL». Их можно использовать в значительно более широком диапазоне рН (3—14) и даже автоклавировать при температуре 120оС. Они обладают еще большей жесткостью, выдерживают длительный контакт с 8 М мочевиной и 6 М гуанидинхлоридом, а также со многими органическими растворителями (этанолом, ацетоном, хлороформом, пиридином, ацетонитрилом, дихлорэтаном, ДМФ, ДМСО и др.). Последнее обстоятельство имеет важное значение для осуществления реакций модификации.
В настоящее время агароза широко применяется как в колоночной хроматографии в виде модифицированных сорбентов состоящих из сферических гранул строго определенного размера (Q-Sepharose, SP-Sepharose, Phenyl-Sepharose и т.д.), так и в виде гелей, в основном применяемых для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот при молекулярно-биологических и биотехнологических исследованиях.
Полиакриламидный гель
Нити линейного полимера акриламида, сшитые N.N’-метиленбисакриламидом, образуют относительно жесткую и химически инертную пространственную сетку геля, хорошо удерживающую воду. Пористость и жесткость геля определяется процентным содержанием в нем полимера. Гранулированные матрицы полиакриламидного геля (ПААГ) используются только для гель-фильтрации. Рабочий диапазон рН — 3-8. Гель можно автоклавировать; он выдерживает контакт с разбавленными органическими кислотами, 8 М мочевиной, 6 М гуанпдинхлоридом, детергентами. В отличие от агарозы ПААГ «не боится» высушивания. Матрицы поставляются и виде сухих сферических гранул нескольких диапазонов диаметров в интервале от 40 до 300 мкм. При замачивании они сильно набухают и могут связывать, в зависимости от содержания ПААГ, от 3 до 30 мл воды на 1 г сухих гранул.
Полиакриламидпые патрицы выпускают фирмы «Bio-Rad» (под общим названием «Bio-Gel P») и «Roanal» (под названием «Акрилекс»). На основе полиакриловой кислоты выпускают также ионообменники — «Trisacryl» (фирма «LKI3») и «Bio-Rex 70» (фирма «Bio-Rad»).
В целях объединения достоинств описанных выше материалов было создано два новых типа комбинированных матриц — «Sephacryl» и «Ultrogel AcA».
Сефакрилы
Ультрагели типа АсА
«Ultrogel AcA» — еще один вариант жесткой матрицы, обеспечивающей широкие возможности выбора размера пор. Здесь контролируемая пористость ПААГ сочетается с жесткостью агарозы — сетка ПААГ полимеризуется внутри жесткого каркаса агарозы. Химической связи между ними нет, но агароза придает жесткость сферическим гранулам ультрогеля, в то время как их пористость определяет ПААГ. По химической и термической стойкости эта матрица сходна с агарозой; диапазон диаметров гранул — 60—140 мкм. Матрицы типа «Ultrogel AcA» с различным содержанием агарозы и ПААГ в виде водных суспензий поставляют фирмы «LKB» и «113F». Эти матрицы нашли применение не только для гель-фильтрации, но и для синтеза аффинных сорбентов на их основе.
Полистирольные смолы
Нити линейного полимера полистирола, химически «сшитые» молекулами дивинилбензола в жесткую пространственную сетку, выпускаются в виде сухих сферических гранул под торговым названием «смол» («resins»). 
Содержание дивинилбензола варьирует от 2 до 12%, определяя средние размеры пор сетки. Эти размеры обычно малы, так что внутренний объем гранул полистирола доступен только для низкомолекулярных соединений (нуклеотидов, аминокислот, коротких пептидов и др.). Впрочем, имеются и «макроретикулярные» типы смол на основе полистирола; при их изготовлении микрогранулы смолы спекаются в гранулы обычных размеров (30—300 мкм). Внутренний объем таких гранул, представленный свободным пространством, остающимся между микрогранулами, доступен для биологических макромолекул.
Немодифицированные полистирольные смолы гидрофобны. Модификация осуществляется присоединением ионогенных групп по остаткам бензола в пара-положении. Это придает смоле в целом гидрофильность, хотя возможность и склонность к гидрофобным взаимодействиям с фракционируемым материалом сохраняется. Для хроматографии компонентов белков и нуклеиновых кислот в водных элюентах смолы на основе полистирола применяются только в качестве матриц ионообменников. Благодаря частоте расположения в пространстве остатков бензола эти матрицы отличаются высоким содержанием ионогенных групп. Химически они очень устойчивы (можно промывать 4 н. НС1 и 2 н, NaOH) и выдерживают нагревание до 120°C. При замачивании гранулы набухают, связывая (в зависимости от пористости) от 1 до 3 мл воды на 1 г сухой смолы. Макроретикулярные ионообменники на основе полистирола можно, вообще говоря, использовать для хроматографии белков, но при этом следует опасаться денатурации за счет гидрофобных взаимодействий белковых глобул с материалом матрицы.
Для липофильных белков мембран такое взаимодействие, по-видимому, опасности не представляет.
Наиболее популярные ионообменники на основе полистирола выпускаются под торговыми названиями «Dowex» (фирма «Dow Chemical Со») и «Amberlyte» (фирма «Rohm and Haas») и перепродаются большинством фирм, торгующих биохимическими реактивами. Хороню промытые и отсеянные обменники тина «Dowex» для аналитических целей поставляет фирма «Bio-Rad» под наименованием «Bio-Rad AG». Повышенные требования, предъявляемые к ионообменникам для современных аминокислотных анализаторов, привели к разработке специальных полистирольных смол («Aminex», «Durrum» и др.) с малым разбросом размеров около номинальных значений порядка 10—20 мкм. Для высокоэффективной хроматографии при высоких давлениях (ЖХВД) производят так называемые «пленочные ионообменники, у которых пленка полистпрольной смолы толщиной около 1 мкм фиксирована на поверхности стеклянных шариков диаметром 4 мкм («Whatman-Pellionex»).
Пористое стекло
ПРИНЦИП ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ (подробно в картинках)
На колонку, упакованную сорбентом, наносят раствор образца.
Важно : лимитирующим является объем раствора образца; для аналитических разделений он не должен превышать 0,1% от C V (общего объема колонки), а для препаративной очистки он должен быть не выше 8-10% от C V ; в противном случае разделения сложно будет достичь!
Раствор образца, допустим, содержит три типа веществ: высокомолекулярные, среднего размера и низкомолекулярные.
Высокомолекулярные не могут поместиться в поры сорбента, поэтому их объем удержания равен свободному объему колонки. Они элюируются первыми.
Средние частицы помещаются в поры сорбента, но не полностью. Поэтому их объем удержания немного выше свободного объема. Они элюируется вторыми.
Маленькие вещества долго путешествуют внутри пор сорбента, могут там заблудиться и найтись не скоро. Их объем удержания намного выше свободного (чаще всего их объем удержания приближается к общему объему колонки, т.е. 100% C V ). Они вымываются последними.
МАТРИЦЫ ДЛЯ Гель-Фильтрации
Гель – гетерогенная система, в которой подвижная фаза (обычно водная) всегда находится внутри пор неподвижной фазы, называется гелевой матрицей
ОСНОВНЫЕ ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ.
Очистка веществ, фракционирование по размеру
Разделение мономеров, димеров и агрегатов более высокого порядка
Обессоливание веществ и «перебуферирование»
Анализ высокомолекулярных примесей
Определение молекулярной массы аналита
При гель-фильтрации белков необходимо принимать меры для предотвращения их адсорбции на сорбенте и не допускать их денатурации.
Определение молекулярной массы белка методом гель-хроматографии
Измерение объема элюции (V Э ).
Гель-хроматография, как метод определения молекулярной массы, кроме простоты и быстроты, имеет дополнительное преимущество. Не требуется выделять белок в чистом виде, так как примеси других белков не мешают определению. Каждый из них проходит через колонку со свойственной ему скоростью, определяемой молекулярной массой. Это обстоятельство широко используется в энзимологии, когда оказывается возможным определение молекулярной массы даже очень небольшого количества фермента в присутствии других белков, не обладающих аналогичной каталитической активностью.