Гипермоторная эпилепсия сна ассоциированная с мутацией в гене nprl3
Гипермоторная эпилепсия сна ассоциированная с мутацией в гене nprl3
Тель-Авивский университет, Тель-Авив, Израиль
ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава России, Казань, Россия; ФГАОУ ВО «Казанский федеральный университет», Казань, Россия
АО «Медицинский университет Астана», Астана, Казахстан
Казанская государственная медицинская академия
Современные достижения в области генетических исследований идиопатических генерализованных эпилепсий
Журнал: Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. Спецвыпуски. 2018;118(10-2): 56-60
Афави З., Гамирова Р. Г., Джаксыбаева А. Х., Есин Р. Г. Современные достижения в области генетических исследований идиопатических генерализованных эпилепсий. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. Спецвыпуски. 2018;118(10-2):56-60.
Afawi Z, Gamirova R G, Jaxybayeva A Kh, Esin R G. Modern achievements in genetic studies of idiopathic generalized epilepsies. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii imeni S.S. Korsakova. 2018;118(10-2):56-60.
https://doi.org/10.17116/jnevro201811810256
Тель-Авивский университет, Тель-Авив, Израиль
В обзоре представлены современные данные в области генетики идиопатических генерализованных эпилепсий. Идентифицированные гены кодируют различные структуры нейронов, включая вольтажзависимые каналы, рецепторы нейромедиаторов, белок-ассоциированные ионные каналы и синаптические белки. Приведено описание идентифицированных генов, являющихся причинным фактором идиопатических генерализованных эпилепсий, и обсуждаются вопросы дальнейших перспектив использования молекулярно-генетических исследований.
Тель-Авивский университет, Тель-Авив, Израиль
ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава России, Казань, Россия; ФГАОУ ВО «Казанский федеральный университет», Казань, Россия
АО «Медицинский университет Астана», Астана, Казахстан
Казанская государственная медицинская академия
Научные достижения последних десятилетий отчетливо демонстрируют, что существует генетическая причина или, по крайней мере, ее вклад в развитие многих эпилепсий и эпилептических синдромов. Число генов, роль которых признана как причинный фактор, при разных формах эпилепсии резко возросло. Идентифицированные гены связаны с различными компонентами нейронных связей, включая вольтажзависимые каналы, рецепторы, белок-ассоциированные ионные каналы и синаптические белки. Открытие этих генов позволило получить полезную информацию о молекулярной основе эпилептогенеза.
Термин «генетическая эпилепсия» означает, что основной ее причиной является мутация гена. Некоторые мутации генов, вызывающие эпилепсию, могут возникать de novo. В этом случае отсутствует схема наследования, которую можно было бы проследить по родословной. Кроме того, большинство генетически обусловленных эпилепсий имеют сложный, неменделевский тип наследования, который подразумевает взаимодействие множества генов. Тем не менее у относительно небольшого числа синдромов определяются менделевские паттерны наследования. Они связаны с мутациями отдельных генов, которые могут быть идентифицированы с помощью генетического тестирования. Достижения в области молекулярной генетики изменили нашу точку зрения относительно генетики эпилепсии. Появление методов массового параллельного секвенирования, так называемого секвенирования следующего поколения (next-generation sequencing — NGS), таких технологий, как секвенирование экзома и целого генома, применение полногеномного поиска ассоциации (Genome-Wide Association Studies — GWAS) и сравнительной геномной гибридизации (CGH) помогли обнаружить участие большего количества генов в редких расстройствах, наследуемых по менделевскому типу, сложных заболеваниях и хромосомных болезнях и обеспечили одновременно новые методы, ускоряющие геномные исследования при генетических заболеваниях человека [1].
Достижения в области молекулярной генетики генерализованных эпилепсий помогли внести изменения как в классификацию эпилептических синдромов, так и в понимание эпилептогенеза, а также в диагностический алгоритм при определении формы эпилепсии. Рассмотрим некоторые из них.
Изменения в классификации эпилепсии. Международная противоэпилептическая лига (ILAE) предложила в 2017 г. новую терминологию и классификацию эпилепсии и эпилептических синдромов. В рамках этих изменений генерализованные приступы в настоящее время рассматриваются как «возникающие в определенной точке с быстрым двусторонним билатеральным распространением по нейронным сетям» [2]. Эти сети включают как корковые, так и подкорковые структуры, такие как таламокортикальные или лимбические нейрональные сети, т. е. не обязательно возникают только в коре головного мозга.
Термин «идиопатическая генерализованная эпилепсия» (ИГЭ), который ранее использовали для описания эпилепсии, не имеющей другой причины, кроме предполагаемой генетической этиологии, теперь заменен более строгим определением «генетическая эпилепсия». Этот термин теперь будет использоваться для описания эпилепсий, которые являются непосредственно следствием известного или предполагаемого генетического дефекта, что можно установить с помощью конкретных молекулярно-генетических исследований (например, SCN1A при синдроме Драве) либо исследования семейных эпилепсий. Все остальные эпилепсии относятся либо к структурным/метаболическим, либо к эпилепсиям с неизвестной этиологией.
Однако среди генерализованных эпилепсий выделяется общепризнанная и часто встречающаяся подгруппа с первично генерализованными приступами, к которой относятся детская абсансная эпилепсия (ДАЭ), юношеская абсансная эпилепсия (ЮАЭ), юношеская миоклоническая эпилепсия (ЮМЭ) и эпилепсия с изолированными генерализованными тонико-клоническими приступами, в отношении которой можно сохранять привычную терминологию — ИГЭ [2].
Уточнение генетических маркеров ИГЭ является вызовом настоящего времени. Недавние исследования генетики эпилепсии [3] выявили неожиданные механизмы и новые закономерности наследования заболевания. В целом ИГЭ имеют сложное мультифакторное наследование, в котором участвуют несколько генов. Ранее идентифицированные гены являются компонентами нейронного сигнала, кодируют вольтажзависимые ионные каналы, лигандзависимые каналы, рецепторы нейромедиаторов, синаптические белки. В семьях, где в разных поколениях прослеживается ИГЭ, фенотип родственников эпилепсии различается. Пока нет доказательств того, что при полигенном наследовании какой-то ген определяет значительный или среднезначительный риск развития эпилепсии. Открытие этих генов также обеспечило полезную информацию о молекулярной основе эпилептогенеза. Вполне вероятно, что существует гораздо больше генов, связанных с эпилепсией, которые еще предстоит открыть.
ДАЭ. Типичные абсансы являются первично-генерализованными приступами (ILAE, 2017), которые встречаются у детей школьного возраста, как правило, в возрасте от 4 до 9 лет [4]. Типичные абсансы характеризуются внезапным прекращением движений, замиранием, сопровождаются морганием. Иногда может быть легкая утрата тонуса тела, в результате чего ребенок наклоняется вперед или слегка назад. В отличие от других типов приступов, абсансные приступы не имеют ауры. При диагностике ДАЭ типичные абсансы необходимо дифференцировать от атипичных, которые могут возникать в более раннем возрасте. На ЭЭГ ребенка с ДАЭ регистрируется типичный паттерн, известный как генерализованные разряды из комплексов пик—медленная волна с частотой 3 Гц. Генетические исследования обнаруживают гетерогенные мутации в генах CACNA1H, GABRA1, GABRB3, GABRG2, CHRNA4 [5]. Имеются сообщения [6] о миссенс-мутации в гене JRK, которая была связана с ДАЭ, впоследствии трансформировавшаяся в ЮМЭ (см. таблицу). 
Гены, ассоциированные с возникновением ИГЭ Согласно результатам исследования К. Everett [7] ДАЭ может быть ассоциирована с мутацией гена CACNG3.
ЮАЭ. Заболевание начинается чаще всего в возрасте от 9 до 13 лет, иногда позднее — в пубертатном периоде, проявляется типичными короткими абсансами юношеского типа и генерализованными тонико-клоническими судорогами, а также ЭЭГ-паттерном генерализованных разрядов из комплексов пик—медленная волна с частотой 3 Гц и более. Генетические мутации обнаруживают в генах EFHC1 [8] и CLCN2 [9].
ЮМЭ. Заболевание манифестирует в период полового созревания и характеризуется эпилептическими приступами в виде билатеральных одиночных или множественных, аритмичных, нерегулярных вздрагиваний, миоклонических подергиваний в виде рывков, локализующихся преимущественно в руках, мышцах плечевого пояса. У некоторых пациентов такие вздрагивания могут вызывать внезапные падения. Нарушения сознания не наблюдаются. Генерализованные тонико-клонические приступы, являясь вторым типом приступов при этой форме, встречаются более чем у 90% пациентов с ЮМЭ и реже (приблизительно у 30% пациентов с ЮМЭ) может отмечаться третий тип приступов — нечастые типичные абсансы юношеского типа. Приступы обычно возникают вскоре после пробуждения и часто провоцируются депривацией сна. На межприступной и иктальной ЭЭГ регистрируются короткие диффузные разряды из быстрых недостаточно регулярных комплексов пик—медленная волна, полипик—медленная волна. Часто отмечается фоточувствительность. Терапевтический ответ на соответствующие противоэпилептические препараты обычно благоприятный. ЮМЭ является генетически и фенотипически гетерогенным синдромом. Наследование ЮМЭ различно, хотя есть некоторые подтипы, которые имеют менделевский (чаще — аутосомно-доминантный или реже — аутосомно-рецессивный) тип наследования. Для наследования ЮМЭ характерна неполная пенетрантность (степень проявления гена в признаке), т. е. некоторые люди, наследующие мутацию или мутации генов, ответственных за развитие ЮМЭ, не имеют клинической картины заболевания. Согласно данным А. Delgado-Escueta [10] 5 менделевских генов CACNB4, CASR, GABRА1, GABRD и Myoclonin1/EFHC1, 3 SNP-аллеля в BRD2, Cx-36 и ME2 и микроделеции в 15q13.3, 15q11.2 и 16p13.11 связаны с фенотипом ЮМЭ. Кроме того, при ЮМЭ обнаруживают мутации в гене SCN1A. Несмотря на сходство клинической картины фенотип ЮМЭ может различаться среди родственников, даже в случае однояйцевых близнецов (при наследовании одной и той же мутации в одном и том же локусе), среди которых один близнец может иметь миоклонии и генерализованные судорожные приступы, а другой — только типичные абсансы.
Эпилепсия с изолированными генерализованными судорожными приcтупами (ЭГСП). Этот синдром определяют изолированные первично-генерализованные тонико-клонические приступы, возникающие в любое время в течение дня, но чаще после пробуждения. Заболевание манифестирует в возрасте от 6 до 20 лет, чаще у мужчин. Приступы могут быть спровоцированы депривацией сна и употреблением алкоголя. Распространенность синдрома неизвестна, и данные о ней значительно различаются. Это, несомненно, является следствием значительного фенотипического перекрытия данного синдрома с ЮАЭ и ЮМЭ. Характеристика ЭЭГ соответствует паттернам генерализованных разрядов из комплексов пик—медленная волна и полипик—медленная волна с частотой 3 Гц и более. При анализе мутаций большого числа семейств с этим синдромом преимущественно выявляли мутации в гене CLCN2 [11].
Достижения в области технологий. Начало XXI века ознаменовалось тем, что в практической медицине стало возможным применение новых молекулярно-генетических методов. К наиболее распространенным методам детекции генетических нарушений можно отнести аллель-специфичную полимеразную цепную реакцию (ПЦР), ПЦР в реальном времени, секвенирование ДНК и гибридизацию с использованием ДНК-чипов. Благодаря развитию технологий в качестве стандартного появился метод массивного параллельного секвенирования NGS для определения нуклеотидного состава молекулы ДНК, секвенирования больших участков белок-кодирующих областей генома человека. Термин «идиопатическая генерализованная эпилепсия» объединяет различные подходы к крупномасштабной расшифровке генетической информации.
Массивное параллельное секвенирование. Появление технологий массивного параллельного секвенирования позволило не только увеличить производительность и скорость прочтения до миллиардов пар оснований, но и существенно снизить стоимость анализа. Массивное параллельное секвенирование имеет пропускную способность обработки миллионов последовательностей, читая ДНК одновременно. На платформах NGS проводят параллельное секвенирование пулированных нуклеиновых кислот, выделенных из большого количества различных образцов. Для дифференцировки исследуемых образцов используют наборы штрих-кодов или индексов (до 96 вариантов), представляющих собой олигонуклеотиды известной последовательности. Для завершения эксперимента могут потребоваться только один или два прохода оборудования. Три платформы доступных секвенаторов включают 454 GS FLX (Roche), Solexa (Illumina) и SOLiD (Life Technologies), которые используют следующие подходы: секвенирование путем синтеза (Sequencing by Synthesis), секвенирование путем лигирования (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection). Эти методы имеют исключительно высокую пропускную способность, большую точность и способны обеспечивать более дешевые анализы. Секвенирование на платформах NGS состоит из нескольких этапов. На первом этапе осуществляют процесс подготовки библиотеки ДНК, который включает ферментативное или ультразвуковое фрагментирование ДНК с последующим присоединением к полученным фрагментам ДНК универсальных олигонуклеотидных адаптеров известной последовательности с помощью ПЦР. Адаптеры необходимы для дальнейшей амплификации фрагментов. При проведении анализа необходимо не более 50 нг ДНК на входе для создания библиотеки. Подобный подход может быть использован при определении de novo последовательности генома. Платформы NGS производят более короткие отрезки (35—250 пар нуклеотидов в зависимости от платформы), по сравнению с капиллярными секвенаторами (650—800 пар нуклеотидов), что также может иметь значение для их использования при секвенировании de novo и ресеквенировании генома. Эти платформы имеют высокую надежность и являются экономически эффективными [12].
Помимо собственно технологии секвенирования методы NGS различаются по объему выполняемого анализа. Так, полногеномное секвенирование подразумевает прочтение практически всей геномной ДНК, включая некодирующие последовательности. Таргетное секвенирование, напротив, позволяет сконцентрировать усилия на анализе определенного набора диагностически значимых генов. Наконец, полноэкзомное секвенирование основано на оценке всех кодирующих последовательностей генома [13].
Таргетное секвенирование и эпилептическая панель генов. Специфические панели эпилептических генов стали доступны для определения вариантов последовательностей, полной или частичной делеции гена и дупликации множественных генов. Панели генов создаются лабораториями для упрощения диагностики генетических заболеваний, объединяя гены, специфичные для конкретного синдрома, заболевания или группы заболеваний (например, в панель «наследственные эпилепсии», как правило, включаются все гены, мутации в которых провоцируют возникновение приступов, а также гены-кандидаты, роль которых вероятна). По сути они представляют собой заранее подготовленные матрицы с нанесенными на них известными последовательностями нуклеотидов выбранных генов. Доступные панели не требуют предтестовой строгой корреляции генотипа фенотипу, что, например, необходимо при анализе одного гена. Преимуществом этих панелей является возможность обнаружить внутригенную делецию ниже разрешения хромосомного микроматричного анализа, что также может быть пропущено Сенгер-секвенированием.
Вариация числа копий генов. Вариация числа копий генов (Copy number variation — CNV) — сегмент ДНК размером не менее 1 кб играет все более признанную роль в генетике эпилепсии. I. Helbig и соавт. [14] сообщили о первом крупном участке, содержащем CNV, предрасполагающем к генетическим генерализованным эпилепсиям. Было подсчитано, что существует около 1500 регионов вариаций числа копий в геноме человека, разбросанных по 360 Мб (примерно 12%). Успех в выявлении моногенных генов эпилепсии основывается прежде всего на традиционном генетическом картировании больших родословных с менделевским наследованием [15]. Однако сложная этиология генерализованных генетических эпилепсий с несколькими значимыми генетическими, но и внешними факторами требует большего объема выборки с достаточной мощностью для выявления ответственных генов. Несколько крупных исследований выявили геномные «горячие точки», которые предрасполагают к идиопатической эпилепсии, включая 1q21.1, 15q11.2, 15q13.3, 15q11—q13, 16p11.2 и 16p13.11. Вариации числа копий возникают в этих регионах из-за неаллельной гомологичной рекомбинации между фланкирующими сегментными дупликациями. Специфические гены, ответственные за восприимчивость к эпилепсии, не были четко определены в этих CNV, хотя, например, были обнаружены варианты числа копий с участием известных генов эпилепсией, таких как SCN1A или KCNQ2. Метод хромосомного микроматричного анализа, выявляющий вариации числа копий, может также быть использован при диагностике генетической эпилепсии. Такие подозрения могут возникнуть при наличии у пациента дисморфичных признаков, задержки в психическом развитии, при расстройстве аутистического спектра или отягощенном по эпилепсии семейном анамнезе.
Полноэкзомное и полногеномное секвенирование. Несмотря на то что суммарная протяженность экзонов, т. е. участков ДНК, кодирующих белки, составляет всего 1% генома, большинство мутаций, имеющих медицинскую значимость, локализуется именно в экзонах. Полноэкзомное секвенирование в настоящее время доступно клиницистам и может предоставить информацию о предполагаемых патогенных вариантах не только в известных генах, связанных с конкретным синдромом эпилепсии, но и о мутациях в новых, еще не описанных генах, особенно в случаях, если фенотип эпилепсии отличается от ранее наблюдаемых. При применении к трио (пациент и оба биологических родителя) полноэкзомное секвенирование обеспечивает эффективный подход к обнаружению как мутаций de novo, так и наследуемых мутаций в кодирующих участках большинства генов в геноме человека. Однако он имеет ряд ограничений, таких как невозможность обнаружить вариации числа копий, аномалии метилирования и мутации в некодирующих областях [16]. Полногеномное секвенирование, которое широко проводится в рамках научных исследований, также становится доступным в клинике и будет обеспечивать средства для анализа как точечных мутаций, так и вариаций числа копий по всему геному. Как полноэкзомное, так и полногеномное секвенирование при широком применении будет решать схожие вопросы. В настоящее время практика применения полноэкзомного и полногеномного секвенирования к трио, несмотря на дороговизну, обеспечивает огромную эффективность при анализе вариантов de novo. Применение полноэкзомного и полногеномного секвенирования наиболее оправдано в случае диагностики редких болезней, а также при заболеваниях, обладающих высокой генетической гетерогенностью, каковыми являются ИГЭ [17]. Полногеномное секвенирование также должно привести к выявлению множества дополнительных вариантов с неопределенной клинической значимостью у больных с эпилепсией и возможной идентификации новых генов, связанных с этим заболеванием, в том числе у пациентов с ИГЭ. В то же время в связи с растущим объемом публично доступных данных все чаще возникает необходимость повторной оценки результатов генетического исследования, особенно в случае их неопределенной клинической значимости. Лаборатории, выполняющие клиническое генетическое тестирование для лечения эпилепсии, как правило, готовы повторно оценить потенциальную патогенность вариантов, но в настоящее время это делается в особых случаях и только по просьбе лечащих врачей.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 17−29−09096.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Гипермоторная эпилепсия сна ассоциированная с мутацией в гене nprl3
Эпилепсия — одна из распространенных форм неврологической патологии детского возраста. Частота эпилепсии в популяции достигает 0,5—0,75%, а среди детского населения — до 1% [1]. Распространенность фебрильных судорог достигает около 5% среди детей до 6 лет, а в некоторых регионах мира — до 8—14%. У 70% пациентов эпилепсия дебютирует в детском и подростковом возрасте.
Международная лига Комиссии по классификации и терминологии эпилепсии (ILAE) рекомендовала разделение заболевания по этиологии на 3 категории: генетическая, структурная/метаболическая и эпилепсия неуточненной этиологии [2].
Наиболее интересными с точки зрения генетики являются идиопатические формы эпилепсии (ИЭ), представляющие собой самостоятельные заболевания, не связанные с органическим поражением мозга или другими болезнями. Примерно в 70% случаев ИЭ впервые возникает в детском возрасте.
ИЭ традиционно рассматриваются как случаи с высокой наследуемостью, о чем свидетельствуют наследственная отягощенность и высокая степень конкордантности среди монозиготных близнецов (65%) по сравнению с гетерозиготными (12%) [3]. ИЭ может быть вызвана дефектом одного гена (моногенные формы), сложным взаимодействием множественных генов (полигенные формы), которые имеют вариант восприимчивости, или хромосомными аберрациями [4]. Пока не ясно, какие гены способствуют развитию эпилепсии, но наши знания о рисках, связанных с определенными генами и хромосомами, в последние годы быстро расширяются, главным образом, благодаря достижениям в области молекулярной генетики [5].
На основании данных, полученных при молекулярно-генетических исследованиях семей, страдающих различными моногенными формами ИЭ, а также принимая во внимание современные представления о ее патофизиологических механизмах, можно выделить следующие группы генов, участвующих в ее развитии: гены потенциалзависимых ионных каналов (натриевый, кальциевый, хлорный, калиевый); гены рецепторов и переносчиков нейромедиаторов торможения и возбуждения (гамма-аминомасляная кислота — ГАМК, серотонин, глутамат) и др. [6].
Гены потенциалзависимых натриевых каналов являются важной группой генов, принимающих участие в развитии И.Э. Кроме того, многие противоэпилептические препараты (ПЭП) оказывают свое действие путем ингибирования активности этих каналов. Мутации в генах SCN1A, SCN2A и SCN1B вовлечены в патогенез генерализованной эпилепсии с фебрильными судорогами плюс (ГЭФС+, OMIM: 604233) и тяжелой миоклонической эпилепсии новорожденных (ТМЭН, OMIM: 607208) [7—9]. Мутации в гене SCN1A встречаются в 10—20% случаев ГЭФС+ и 80—90% случаев синдрома Драве [10]. На сегодняшний день не установлено корреляций между фенотипом и генотипом при SCN1A-ассоциированных эпилепсиях. Однако показано, что мутации, приводящие к терминации синтеза белка, ассоциированы с более тяжелым фенотипом эпилепсии [9]. В последние годы также значительно расширился спектр идентифицированных детских эпилептических энцефалопатий, ассоциированных с мутациями в гене SCN1A. Сюда включены криптогенная фокальная и генерализованная эпилепсия, синдром Дузе (миоклонически-астатическая эпилепсия), синдром Леннокса—Гасто [11] и так называемая вакцин-ассоциированная энцефалопатия [12].
Цель настоящей работы — выявление и изучение мутаций и полиморфизмов в генах натриевых каналов, детерминирующих развитие ИЭ.
Материал и методы
Выборка пациентов была составлена из больных с ИЭ, наблюдающихся в Научно-практическом центре медицинской помощи детям с пороками развития челюстно-лицевой области и врожденными заболеваниями нервной системы.
Исследование гена SCN1A проведено у 53 пациентов согласно алгоритму, разработанному в генетической лаборатории указанного центра.
При обнаружении у больного мутаций в гене SCN1A обследование на найденный генетический дефект проводилось у родителей.
Ген SCN1A состоит из 26 экзонов, расположен на длинном плече 2-й хромосомы (2q24.3) и кодирует альфа-субъединицу потенциалзависимого натриевого канала. Мутации в гене SCN1A, определяющие развитие эпилепсии, распределены равномерно по всем экзонам. После анализа литературы и базы данных BLAST, GeneCards для дальнейшего исследования были выбраны 20 экзонов гена SCN1A, в которых сосредоточены до 80% от всех мутаций при синдроме Драве и часто при других формах эпилепсии. Дизайн праймеров 5-го экзона гена SCN1A осуществлен таким образом, чтобы захватить далеко расположенные интронные полиморфизмы (rs3812718, rs3812719).
Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови методом фенол-хлороформной экстракции. Для поиска мутаций в экзонах и прилегающих интронных последовательностях гена SCN1A была проведена полимеразная цепная реакция (ПЦР), в которой на каждую реакцию объемом 25 мкл была использована реакционная смесь следующего состава: 2,5 мкл 10хбуфера для ПЦР, 2 мкл 25 мМ смеси dNTP, по 0,5 мкл каждого праймера и 1 ед. Taq-полимеразы. ПЦР проводили при следующих условиях: 95 °C — 5 мин, затем 30 циклов 94 °C — 40 с; 55 °C, 57 °C или 60 °C (для каждого экзона своя температура отжига) — 40 с; 72 °C — 40 с и финальная элонгация 72 °C — 3 мин. Качество полученных ПЦР-продуктов оценивали в 8% ПААГ (разделение при 300 В 1 ч с последующей окраской нитратом серебра).
Прочтение нуклеотидных последовательностей выполнено на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3500xl Genetic Analyzer. Анализ полученных данных и сравнение секвенограмм с референсными последовательностями проводили с использованием программ Seguencing Analysis (Applied Biosystems), Seqman (Lasergene DNAStar) и Mega 5.2.
В рамках проведенного исследования были также обследованы 40 пациентов с различными клиническими формами ИЭ и резистентностью к ПЭП. В результате анализа данных литературы нами были подобраны 34 основных гена, мутации в которых наиболее часто связаны с развитием тяжелых форм ранних эпилептических энцефалопатий у детей.
Выделение геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови, полученной от обследованных детей, проводили с помощью системы MagNA Pure LC 2.0 согласно протоколу производителя. Последующее таргетное ресеквенирование областей 34 генов методом высокопроизводительного секвенирования выполнено на приборе 454 Sequencing GS Junior (Roche) с использованием олигонуклеотидных зондов NimbleGen согласно протоколу производителя. Функциональные эффекты выявленных мутаций, клиническая значимость которых не описана в базах данных мутаций гена SCN1А, оценивали с использованием программы PolyPhen-2.
Результаты и обсуждение
На первом этапе работы при исследовании 26 экзонов гена SCN1А методом прямого секвенирования по Сэнгеру у 53 пациентов выявлено 7 мутаций: нонсенс-мутации — с.3022G>T, c.3637C>T, миссенс-мутации — c.1144G>T, c.80G>C, c.1603C>T, c.2427G>A и «молчащий» полиморфизм — с.1131A>C. В табл. 1 представлена клиническая значимость выявленных изменений в гене (по данным литературы и базы данных вариантов SCN1A). Сведения о возможном фенотипическом проявлении мутаций c.2427G>A (14-й экзон) и c.1603C>T (10-й экзон) в доступных базах данных отсутствуют. Последующий биоинформатический анализ указанных нуклеотидных замен в гене SCN1A с использованием программы Polyphen-2 показал, что мутации приводят к замене аминокислоты в белке с последующим изменением его функции и могут оказывать повреждающее действие (балл — 1,0).
Таблица 1. Результаты выявления мутаций в гене SCN1А
В случае обнаружения мутаций c.80G>C (пациент 1) и c.3637C>T (пациент 2) нам был доступен материал на исследование от обоих родителей (рис. 1). Анализ 1-го экзона гена SCN1A у родителей пациента 1 показал наличие мутации c.80G>C в гетерозиготном состоянии у матери. В анамнезе матери отсутствуют какие-либо клинические признаки эпилепсии, но присутствуют периодические приступы мигрени. Проведенные молекулярные исследования и генеалогический анамнез могут дать основание для предположения о возможном наследовании патологического аллеля у данного больного от родителя. Проведенный анализ экзона 18 у родителей пациента 2 с мутацией c.3637C>T не выявил у них аналогичных изменений, что может свидетельствовать о спорадическом характере (de novo) найденного изменения у пробанда.
Рис. 1. Результаты исследования родителей пациентов 1 и 2.
В литературе в отношении генотип-фенотипических корреляций в группе пациентов с ГЭФС+ представлены данные о наследовании мутаций в гене SCN1A по отцовской линии. Авторы этих исследований предположили, что наибольшая частота мутаций гена SCN1A, полученных от отца, может быть связана как с более высоким риском мутационных событий в течение множественных митозов, возникающих в процессе сперматогенеза в сравнении с оогенезом, так и с повышенной восприимчивостью к мутагенезу ДНК сперматозоидов [13]. Также возможно, что некоторые мутации, как отцовского, так и материнского происхождения, являются результатом соматического или гонадного мозаицизма [14].
В литературе есть описание 5 семей, пробанды в которых унаследовали мутации SCN1A [15, 17]. В двух семьях матери пробанда с миссенс-мутациями в гене SCN1A не имели каких-либо проявлений судорожного синдрома, в то время как у остальных родителей (мать и два отца) были или фебрильные судороги, или парциальная эпилепсия. Авторы высказали предположение, что мозаицизм по мутациям в гене SCN1A не проявляется клинически или обусловливает более мягкое проявление судорожного синдрома, в зависимости от количества клеток в головном мозге, несущих эти генетические дефекты [18].
При анализе полиморфизмов гена SCN1A как возможных кандидатов на роль маркеров генетической предрасположенности к ИЭ и фармакорезистентности к ПЭП был определен аллельный статус следующих SNP: в кодирующих регионах — с. 3199G>A (rs2298771), c.1212A>G (rs7580482) и прилегающих интронных областях — IVS4−106G>T (rs3812719), IVS4−242T>C (rs2217199), IVS4−91G>A (rs3812718), IVS9+52G>A (rs6432861), IVS2+66T>C, IVS18+33 (rs76743139) и IVS18+55 (rs76220226).
Важнейшей проблемой эпилептологии является фармакорезистентность. Мы предполагаем, что генетические варианты в генах SCN1A, SCN2A и SCN3A, которые являются мишенью действия ПЭП, таких как карбамазепин, фенитоин и ламотриджин, могут оказывать влияние на терапевтический эффект при их применении [19].
В пятнадцати опубликованных исследованиях описывается ассоциация полиморфизмов в генах натриевых каналов с лекарственным ответом на ПЭП [20]. Эти данные литературы были в основном сосредоточены на SNP rs2298771 и rs17183814 (несинонимичные полиморфизмы) и rs3812718 (полиморфизм сайта сплайсинга). Из восьми исследований при изучении связи SNP rs3812718 (генотип АА), rs2298771 (генотип АА) с максимальной и поддерживающей дозами ПЭП в шести работах установлена ассоциация с более высокими уровнями карбамазепина, фенитоина и ламотриджина в сыворотке крови у американских, британских, китайских, русских или тайванских больных с эпилепсией [20].
Существенная связь была отмечена в отношении SNP rs3812718 [21]. T. Abe и соавт. [21] показали клинически значимую ассоциацию аллельного варианта А/А полиморфизма rs3812718 в гене SCN1A с фармакорезистентностью к карбамазепину, фенитоину и ламотриджину [21, 22]. В ряде работ был также показан вклад SNP rs3812718 в развитие гетерогенных и симптоматических эпилепсий [23]. В работе, выполненной Е.В. Криковой [24] на российской популяции пациентов с симптоматической и криптогенной эпилепсией, частота выявления SNP rs3812718 в группе больных была значимо выше, чем в европейской популяции, что может свидетельствовать о потенциальном вкладе полиморфизма в патогенез эпилепсии.
Из всех представленных полиморфных локусов также интересен SNP rs2298771, так как этот полиморфизм приводит к замене аминокислоты в белке. В доступных базах данных SNP полиморфизм с. 3199G>A относится к доброкачественным. Однако по данным литературы, L. Baum и соавт. [25] установили связь SNP rs2298771 с эпилепсией, особенно в популяции индейцев. В другом исследовании, выполненном А. Makoff и соавт. [26], также показана ассоциация SNP rs2298771 с развитием ИЭ.
На втором этапе работы при обследовании детей с эпилепсией с использованием панели генов у 7 (17,5%) из 40 пациентов были выявлены мутации в гене SCN1A (2 нонсенс-мутации, 5 миссенс-мутаций). Клинические и молекулярно-генетические данные приведены в табл. 2.
Таблица 2. Спектр мутаций в гене SCN1A, выявленных у обследованных больных с эпилепсией
У 6 пациентов с отсутствием мутаций в гене SCN1A были выявлены мутации в генах натриевых каналов, кодирующих другие субъединицы: SCN1B, SCN2A, SCN9A.
При подозрении на SCN1A-ассоциированную эпилепсию следует учитывать, что одним из ограничений методов ДНК-диагностики и секвенирования является невозможность обнаружения дупликаций, инверсий, инсерций или делеций больших участков гена, а также изменение числа копий отдельных его фрагментов. С целью избежать ложноотрицательных результатов желательно использовать дополнительные методы диагностики, например хромосомный микроматричный анализ (ХМА). Так, в нашем случае у одного из обследованных пациентов с эпилептической энцефалопатией отсутствовали патогенные мутации в исследуемых генах, однако методом ХМА, выполненным в лаборатории «Геномед», было определено следующее изменение структуры хромосомы: микроделеция размером 2871112 п.н. (164986570−167857682), захватывающий регион 2q24.3 с SCN1A геном.
Далее представлены клинические примеры, в которых в качестве метода молекулярно-генетической диагностики было использовано таргетное секвенирование панели генов.
Пациент Д., 3 года, находился в стационаре с клиническим диагнозом «синдром Драве» (G 40.5).
Из анамнеза жизни: ребенок от 2-й беременности, протекающей на фоне повторных острых респираторных вирусных инфекций и цитомегаловирусной (ЦМВ) инфекции у матери, роды срочные, самостоятельные, масса тела при рождении 3080 г, длина — 52 см, оценка по шкале Апгар — 7 баллов. Период новорожденности протекал без особенностей, развитие до 6 мес по возрасту.
Анамнез заболевания: в возрасте 6 мес на фоне инфекции отмечен первый приступ судорог с последующим их учащением. Наследственный анамнез по эпилепсии не отягощен.
В неврологическом статусе на момент поступления в стационар в возрасте 3 лет состояние довольно тяжелое за счет клонико-тонических судорог, начинающихся как фокальные, затяжного характера с серийным течением и фебрильной температурой на фоне острой ЦМВ-инфекции, задержка психомоторного развития, повышение нервно-рефлекторной возбудимости, агрессивность в поведении. При проведении видео-ЭЭГ-мониторинга отмечены региональная эпилептиформная активность в правой и левой лобно-центральных областях, высокий индекс эпилептиформной активности (рис. 2).
Рис. 2. ЭЭГ-мониторинг больного Д. Объяснение в тексте.
Пациент консультирован клиническим генетиком. Диагноз «синдром Драве» был подтвержден молекулярно-генетическим методом (таргетное секвенирование панели генов). У пациента были обнаружены следующие мутации: ген SCN1A — нонсенс-мутация: chr2:166912936, c.458G>A, p. Trp153X (OMIM: 607208) ранняя инфантильная эпилептическая энцефалопатия (синдром Драве, ТМЭН)); ген SCN9A — миссенс-мутация: chr2:166284599, с.1828C>A, p.Pro610Thr (OMIM: 133020 первичная эритромелалгия).
В стационаре больному была проведена противоэпилептическая терапия, которая позволила достичь положительной динамики в его состоянии.
Пациент К., 7 лет, находилась в стационаре с клиническим диагнозом «идиопатическая генерализованная эпилепсия с фебрильными судорогами плюс» (G40.3).
Из анамнеза жизни: ребенок от 1-й беременности, которая протекала на фоне угрозы прерывания на всем сроке. Роды в срок, экстренное кесарево сечение по причине острой гипоксии. Масса тела при рождении — 3500 г, рост — 51 см, оценка по шкале Апгар — 8 баллов. Наследственный анамнез: у матери отмечались фебрильные судороги.
Анамнез заболевания: после родов ребенок находился около 1 мес в отделении реанимации и интенсивной терапии по поводу врожденного порока сердца. В первые сутки жизни отмечались неонатальные судороги. В возрасте 11 мес дебют фебрильных судорог на фоне высокой температуры (38,2 °С). Неврологом был назначен депакин. На фоне проведенной терапии улучшение состояния (отсутствие приступов в течение 4 лет). Через 3 мес после отмены зафиксирован эпизод афебрильных приступов во время нахождения ребенка в детском саду. Ребенку назначена терапия кеппрой. Последующие 2 года отмечались периодические синкопальные состояния (эпизоды потери сознания, происходящие на фоне духоты, после умственной нагрузки, сопровождающиеся бледностью кожных покровов, головокружением).
В неврологическом статусе на момент поступления в стационар в возрасте 7 лет: синкопальные состояния, задержка психоречевого развития.
При проведении видео-ЭЭГ-мониторинга эпилептиформной активности, эпилептических приступов и их ЭЭГ-паттернов отмечено не было (рис. 3).
Рис. 3. ЭЭГ-мониторинг больного К. Объяснение в тексте.
Пациент консультирован клиническим генетиком. Установленный ранее диагноз подтвержден молекулярно-генетическим методом (таргетное секвенирование панели генов). У пациента были обнаружены следующие мутации: ген SCN1A — миссенс-мутация: chr2:166015636, c.3521C>G, p. Thr1174Ser (OMIM: 604233 ГЭФС+; OMIM: 609634 семейная гемиплегическая мигрень), ген SCN9A — миссенс-мутация: chr2:166251875, с.3329G>A, p. Arg1110Gln, ген SCN1B — миссенс-мутация: chr19:35034060, с.769G>A, p. Gly257Arg.
На фоне проводимой терапии (кеппра) состояние больного с положительной динамикой.
Представленные наблюдения дополняют сформулированные положения о том, что наиболее частыми мутациями, которые обнаруживаются при синдроме Драве как одной из форм ИЭ у детей, являются изменения в гене SCN1A. Учитывая, что в генетическую этиологию большинства форм ИЭ включаются множество генов, тестирование пациентов не должно быть ограничено только исследованием гена SCN1А. C этой целью для поиска молекулярных дефектов как причинных факторов ИЭ целесообразно рекомендовать специализированные диагностические панели генов.
В заключение можно констатировать, что геномная эра привела к существенному расширению возможностей идентификации генов, которые способствуют развитию эпилепсии. Идентификация генов и генетических мутаций, которые приводят к эпилепсии, способствовала нашему пониманию механизмов болезни и синдромов. Выявление мутаций и полиморфизмов в гене SCN1A в группе больных с ИЭ имеет научную и клиническую значимость, а также объясняет наличие фармакорезистентности к проводимой терапии при данной патологии. При изучении SCN1A-ассоциированных эпилепсий (в первую очередь ГЭФС+ и синдрома Драве) более полная информация может быть получена при секвенировании не только отдельных экзонов гена SCN1A, но и путем секвенирования и анализа большего числа других локусов. Ввиду того что эпилептические энцефалопатии, приводящие к тяжелому когнитивному дефекту, полигенны, важно проведение генетического тестирования большего количества генов (в первую очередь генов натриевых каналов — SCN1B, SCN2A, SCN9A и т. д.): подтверждение клинического диагноза; принятие врачом решения о назначении терапии; оценки прогноза течения заболевания и развития ребенка; медико-генетического консультирования родителей при планировании последующей беременности.