Что такое маркер в медицине

«Онконаследственность» и онкомаркеры: кому, когда, какие

Почему анализы на онкомаркеры не используются для массового онкоскрининга? В каких случаях такие тесты информативны? Как выбрать нужный анализ? И в чем «подводные камни» результатов?

Что такое онкомаркеры

Не секрет, что риску рака, в той или иной степени, подвержен буквально каждый из нас. И закономерным стремлением, в такой ситуации, становится выявление патологии на самых ранних, прогностически еще безопасных стадиях.

При этом, многие ошибочно полагают, что анализ на онкомаркеры – как раз и есть тот самый способ раннего онкоскрининга. Однако на деле, такие исследования информативны не для всех и не всегда.

Онкомаркеры представляют собой некие вещества (чаще липидной или белковой природы), синтезируемые клетками организма в ответ на онкологические (как зло-, так и доброкачественные) и воспалительные процессы.

Уже из этого «определения» очевидно, что онкомаркеры – не являются «уникальным кодом» только раковых клеток, то есть не обладают высокой специфичностью. И повышение таких показателей возможно также при, менее опасных, доброкачественных опухолях, и даже «простом» воспалении в «исследуемых» тканях.

Поэтому и использование онкомаркеров в качестве массового онкоскрининга особого смысла, увы, не имеет.

Проведение таких анализов показано только тем, кто имеет отягощенную наследственность. И, особенно, если онкологическими заболеваниями страдают близкие родственники и есть основания опасаться наследственного рака..

А также в качестве прогностического маркера для уже диагностированных случаев рака и контроля эффективности лечения.

Как выбрать

Вероятно, вы уже догадались, что одного маркера – на все виды рака в медицине пока не существует. Поэтому, при желании провериться самостоятельно, необходимо определиться какой из маркеров актуален.

Выбор анализа зависит от:

При этом, при наличии хронических заболеваний «интересующих» органов, желательно сдавать анализ в стадии ремиссии. А также на некоторое время воздержаться от травмирующих (эндоскопия, рентген и другие) исследований и манипуляций.

Сам же перечень онкомаркеров на сегодня насчитывает около 200 показателей, среди которых:

2. анализ мочи на специфический антиген рака мочевого пузыря (0.A14.401);

3. анализ кала на опухолевую пируваткиназу (0.A18.101) ® наиболее специфичный маркер рака толстого кишечника,

4. анализ кала на гемоглобин- трансферрин, способный выявить скрытые кровотечения

А наибольшую связь с наследственностью имеет рак молочной железы и яичников (мутации в генах BRCA 1 и BRCA 2, передающиеся по наследству), толстого кишечника (особенно синдром Линча) и медуллярный рак щитовидной железы.

Получая результаты

Когда анализ будет готов, стоит помнить, что высокие значения в результатах – служат обоснованием не диагноза, а необходимости углубленного обследования. И окончательный «вердикт» в любом случае требует гистологического (биопсия) или цитологического (например, жидкостная цитология шейки матки), а также некоторых инструментальных (рентген, эндоскопия, КТ, МРТ) исследований.

Источник

Что такое онкомаркеры и какие бывают

Рак ― страшное заболевание, не всегда поддающееся лечению, которое обрекает человека на медленное и мучительное угасание. Статистические данные свидетельствуют о стремительных темпах роста онкологии среди населения. На борьбу с раком направлены колоссальные медицинские знания и средства. Достижением является прорыв современных диагностических методов, которые позволяют обнаружить онкологические процессы в ранней фазе развития, еще до появления опухолевого процесса, что делает возможным полное излечение. К одному из наиболее точных видов диагностики по праву нужно отнести лабораторный общий анализ крови на маркеры онкологического процесса. Рассмотрим подробнее онкомаркеры что это.

Онкологические маркеры

Чтобы понять, что такое онкомаркеры, понадобится немного углубиться в медицинские пояснения о маркерах опухолевых процессов в организме. Онкологическим маркером называется специфический белок, появляющийся в крови вследствие развития опухолевого процесса. Онкологические маркеры вырабатываются раковыми клетками либо иммунной системой в ответ на возникновение онкологии.

Злокачественные клетки выделяют антигены в огромных количествах, поэтому любое превышение нормы тех или иных онкомаркеров в кровотоке явно указывает на рост онкологии.

Обнаружить онкологические маркеры доступно по анализу крови, мочи и при помощи гистологического исследования, то есть, взяв образцы пораженных раком тканей.

Онкомаркеры на рак должны соответствовать определенным условиям:

Последний пункт часто не отвечает действительности. Большинство онкомаркеров имеют немалый перечень патологий органов и систем, среди которых, в том числе и доброкачественные образования. Исходя из этого, исследование отдельного онкологического маркера, не позволяет получить сведения о месте дислокации опухоли и полную картину заболевания. Чтобы добиться от исследования на онкомаркеры большей информативности, проводят комплексное изучение нескольких специфических белковых элементов крови. Теперь понятно онкомаркер что это за вещество и как, сделав общий анализ крови, легко определить его качественный и количественный уровень.

Важнейшие онкологические маркеры и их классификация

К нынешнему моменту в области медицины открыто и в достаточной мере изучено около 200 различных онкомаркеров. Наблюдается постоянный рост показателей онкологического процесса. Но в диагностической практике применяются только основные онкомаркеры, коих насчитывается около 20. Подразделяются они на две большие группы по месту обнаружения (гуморальные или тканевые), по химическим признакам (гликопротеины и их углеводные факторы, сахариды, гликолипиды и полипептиды, полиамины, иммуноглобулины) и по биологическим предназначениям.

Классификация онкомаркеров по микробиологическому назначению:

Научными сотрудниками в сфере медицинской диагностики разработаны специальные комплексные программы, включающие в себя набор взаимодополняющих друг друга онкомаркеров, для заключения достоверного диагноза какого-то определенного органа. Существуют общие комплексные тесты крови на онкологические маркеры, подходящие для мужчин и женщин. Благодаря таким исследованиям крови, получится обследовать свой организм сразу на наиболее важные окомаркеры, что сэкономит время, средства и усилия.

О чем свидетельствует наличие онкомаркеров в крови

Значения онкомаркеров, входящих в группу основных показателей опухолевого процесса, не могут служить главным критерием для вынесения окончательного диагноза. Потому как большинство среди упомянутых веществ не являются онкомаркером специфическим. К наиболее часто встречающимся онкомаркерам в крови относится альфа-фетопротеин, который выступает сигнализатором рака печени, головного мозга, яичников у женщин и яичек у мужчин. Тест на онкомаркеры СА 125 также устанавливают онкологические процессы в яичниках. По метаболическому онкомаркеру tu m2 pk выявляют рост злокачественных образований в ЖКТ, легких, почках, грудных железах.

Тест на ХГЧ у мужчин и небеременных женщин обнаруживает рост опухолевых образований семенников и женских половых органов. А у беременных женщин отклонения от нормы в сторону превышения или снижения хорионического гормона указывают на нарушения вынашивания беременности либо отклонения в развитии плода. Раково-эмбриональный антиген (РЭА) продуцируется эпителиальными тканями органов, свидетельствует о карциноме в ЖКТ, поджелудочной, печени, легких или молочных желез. Тест на общий PSA (в свободной и связанной с протеинами форме) определяет наличие и рост опухолевого процесса в предстательной железе.

Кальцитонин превышен в организме при медуллярной онкологи щитовидной железы. Лактатдегидрогеназа отклоняется от нормы при раке печени и некоторых видах онкологических изменений кровотока. Анализ крови на плацентарный лактоген назначается при подозрении на раковые патологии легких, грудных желез и других органов. Уровень пролактина нарушается при аденоме почек, гипофиза и иногда дыхательных путей. Отклонения от нормы показателей паратгормона выступают свидетельством раковых процессов почек, печени, легких, молочных желез.

Эстроген и прогестерон в качестве онкомаркеров указывают на онкологию щитовидной железы.

Тест на микроглобулин бета-2 оповещает о заболеваниях кровеносной системы онкологического характера. В осложненных случаях при большой концентрации он может аккумулироваться в мягких тканях разных органов, нарушая белковый обмен, ― процесс, называемый амилоидной дистрофией. Микроглобулин бета-2 неспецифический онкомаркер может показывать также почечную недостаточность. Для его обнаружения назначается диагностический тест крови, так как в моче микроглобулин выявляется только в остаточной концентрации.

Коэффициент онкомаркеров в крови

В здоровом организме онкологические маркеры находятся в пределах нормы. Любое отклонение от нормальных значений за редким исключением указывает на опухолевые процессы. При расшифровке результатов анализа крови на онкомаркеры медицинскому работнику придется учесть множество сведений, полученных в ходе лабораторной, инструментальной, визуальной и прочих диагностик.

Потому как, несмотря на высокую информативность и достоверность исследования кровотока, существует все же вероятность ложноположительных или ложноотрицательных результатов. Дабы исключить всякую неточность в постановке диагноза, пациенту назначают повторную сдачу анализа крови на онкомаркеры через определенное доктором время.

Норма показателей онкомаркеров по биологическому предназначению:

Организм по своей природе совершенен, ― все процессы в нем отлажены и функционируют на протяжении жизни нормально. Но в силу разных обстоятельств, в человеческом теле может происходить сбой в деятельности какого-либо органа или системы. Если симптомы отклонений в самочувствии слабо выражены, то имеет смысл в комплекс обследования обязательно включить исследование крови на онкологические маркеры, которые соответствуют характеру недомогания. При этом обязательно нужно учитывать не специфичность онкомаркеров как при диагностике, так и при лечении. А также принадлежность к полу, индивидуальные особенности организма и возрастные рамки.

Связать вероятность возникновения рака только с пожилым возрастом было бы неправильно. Детские отделения онкологических центров как это не печально переполнены. На основании этой закономерности стоит обратить внимание на то, что на возникновение онкологии сильное влияние оказывает радиационный фон местности проживания, общая экологическая обстановка, вредные привычки, искусственные консерванты и красители в пище, а также геномодифицированные добавки в ней. Исходя из этого, можно сделать вывод, что если придерживаться здорового образа жизни, правильного рациона и время от времени сдавать кровь на наиболее распространенные онкомаркеры, то уже только благодаря этим простым действиям, удастся существенно снизить риск развития онкологии.

Источник

Что показывает анализ крови на онкомаркеры

Чтобы узнать, что показывает анализ крови на онкомаркеры, необходимо правильно подготовиться и сдать его в первой половине дня. Сделать это можно в лаборатории как при клинике, так и в частном независимом медицинском учреждении с хорошей репутацией. Отметим, что цена анализа крови на онкомаркеры зависит от того, какой маркер нужно проверить, сколько всего таких тестов назначено и надежности выбранной лаборатории.

О чем говорят результаты анализа на онкомаркеры

Онкомаркеры – специфические белковые соединения, которые продуцируются патологическими образованиями в организме либо здоровыми клетками с целью защитить организм от зловредных процессов. В зависимости от этого есть маркеры, которые постоянно присутствуют в организме в минимальном количестве, и есть те, которые появляются только при наличии опухоли. Таким образом, необходимо знать, что показывает анализ крови на онкомаркеры группе риска и тем, кто однажды сталкивался с онкологией.

Данный анализ не назначается в случае отсутствия симптомов, генетической предрасположенности к раку. Лишь в исключительных случаях может быть показан лицам старше 50 лет, которые заняты на вредных производствах.

Результаты тестирования в данном случае могут показать наличие патологического уплотнения на ранней стадии (в зависимости от онкомаркера за 3-5 месяцев до проявления первых симптомов рака), воспалительного заболевания, доброкачественного новообразования, риск патологии у плода. Все это говорит о важности анализа на онкомаркеры в современной диагностике опухолей и патологий развития эмбриона.

Когда нужно сдавать кровь на маркеры и как подготовиться

Сразу отметим то, что показывает анализ крови на онкомаркеры, не является диагнозом. Это лишь первый шаг, который может нести до 95% отображения происходящего в организме. Поэтому проверке нормы онкобелка всегда сопутствуют другие способы обследования, в частности, магниторезонансная и компьютерная томография, ультразвуковое исследование, рентгенография.

Основными показаниями к анализу являются:

Проверка нормы онкомаркеров назначается группе риска и лицам после 50 лет, так как с возрастом продукция этих веществ увеличивается.

Отметим, что анализ крови на онкомаркеры у женщин и мужчин берется только на каждый вид отдельно, согласно назначению доктора. В зависимости от предположительной локации опухоли для ее выявления может быть достаточно проверить только один маркер. Но чаще всего полную картину дает группа, которая наилучшим образом сочетается между собой.

Подготовка в большинстве случаев не требует особых действий, и она практически аналогична требованиям к анализу на биохимию крови:

Также по возможности необходимо предупредить стрессовые ситуации и не нервничать. Помните, что соблюдение данных требований позволит получить качественный и достоверный результат.

Женщинам планировать анализ нужно исходя из периода менструального цикла. Выбрать подходящий день, когда гормональный фон оптимален, поможет соответствующий специалист.

Техника проведения проверки крови на онкобелки

Смысл тестирования сводится к тому, что нужно сдать анализ на онкомаркеры в специализированной лаборатории. Лучшее время для этой процедуры – промежуток между 8 и 12 часами утра.

Перед началом пациента усаживают на кушетку (в некоторых случаях нужно занять лежачее положение), затем берут кровь из вены традиционным способом при помощи шприца и переносят материал в пробирку с крышкой.

Полученная кровь проходит обработку в специальном оборудовании, где отделяется сыворотка от плазмы. Полученная сыворотка – это и есть образец, в который вводят антитела и наблюдают за взаимодействием. Полученная реакция – это результат анализа крови на онкомаркеры, и то, что он показывает, вносится в карточку пациента.

Нормы и расшифровка 10 самых информативных маркеров

Всего в медицине известно более 200 различных онкомаркеров. Но только около 20 признаны наиболее информативными.

Таким образом, имея показания либо предрасположенность к опухолям, необходимо срочно сдать анализ крови на онкомаркеры в инвитро по цене, которая в любом случае будет ниже, чем вероятное лечение.

Источник

Мáркеры для клеток: как ученые «раскрашивают» клетки, чтобы отличить одну от другой

Выделить все важное и отличить от других — вот задача клеточных мáркеров.

Автор

Редакторы

Статья на конкурс «био/мол/текст»: В этой статье рассказывается о том, как ученые научились в широком смысле «раскрашивать» клетки — выделять из общей смеси только те, которые им интересны, а остальные отсеивать. Речь пойдет как о естественных поверхностных и внутриклеточных мáркерах и способах их выявления, так и о более изощренных генетических способах маркировать клетки. Читателя ждет открытие, что штрих-коды бывают не только в магазинах, но и в клетках, а вирус иммунодефицита человека превратился в послушный инструмент.

Конкурс «био/мол/текст»-2017

Эта работа опубликована в номинации «Свободная тема» конкурса «био/мол/текст»-2017.

Генеральный спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

Спонсором приза зрительских симпатий и партнером номинации «Биомедицина сегодня и завтра» выступила фирма «Инвитро».

Что первое приходит на ум неискушенному в науке человеку при слове «мáркер»? Бьюсь об заклад, что добрая половина представляет себе желтый широкий фломастер для выделения текста. Другая половина, наверняка, представляет себе черный нестираемый маркер, которым одно время были исписаны все трубы, заборы и веранды. Начертания «Маша + Саша = Любовь» скрепляли чувства подростков навечно, а менее романтичные, но выразительные фразы надолго свидетельствовали о личной неприязни. Встречались даже стихи. Однако предлагаю уважаемым читателям узнать еще одно значение этого слова — очень научное и так нужное всей современной биологии и биомедицине. В научном понимании и конкретно в клеточной биологии, слово «маркер» в широком смысле означает что-то, что отличает одну живую клетку (или группу клеток) от других. Это может быть молекула на поверхности клеточной мембраны, или какой-нибудь внутриклеточный белок, или вещество, которое синтезируется/накапливается только в этом конкретном виде клеток, или генетическая особенность, присущая только данному типу клеток. Условно все маркеры можно разделить на естественные, которые существуют сами по себе, и искусственные — введенные намеренно. Давайте разберемся с ними по порядку.

Естественные клеточные маркеры и способы их рассмотреть

В многоклеточных организмах существует клеточная специализация. Несмотря на то, что клетки содержат одинаковую ДНК, они отличаются друг от друга: клетки мышц умеют сокращаться, нейроны — проводить нервные импульсы, и так далее. Это происходит из-за того, что в каждом виде клеток работает только определенный набор генов из всего их разнообразия, содержащегося в ДНК. Именно поэтому маркером клеток может служить любой ген, который экспрессируется избирательно — только в каком-нибудь конкретном виде клеток. Особенно удобно, когда такой отличительный ген кодирует белок, располагающийся на поверхности клетки.

Раковые маркеры

Часто можно слышать слово — «онкомáркер». Это классический пример клеточных маркеров: молекул на поверхности опухолевых клеток, которые или не встречается совсем, или присутствуют в гораздо меньшем количестве на поверхности здоровых клеток. Одним из ярких примеров онкомаркеров является HER2-антиген на поверхности клеток рака груди (рис. 1) [1]. HER2 — рецептор эпидермального ростового фактора. В результате аномального увеличения количества копий гена этого рецептора в опухолевых клетках нарушается регуляция клеточного цикла, и опухоль начинает быстро расти. HER2+-варианты рака груди — очень агрессивны [2].

В этом случае у ученых есть целый набор методов, как можно «увидеть» клетки, несущие такой маркер, отличить их от остальных клеток и даже отсортировать: в одну пробирку — клетки с поверхностным маркером (или с несколькими маркерами), в другую — остальные. Эти методы основаны на использовании антител.

Антитела — специальные белки, которые могут распознавать молекулы за счет пространственного взаимодействия. Именно антитела играют важную роль в нашем иммунитете — они связываются с белками или другими молекулами на поверхности бактерий и вирусов, что и запускает иммунную реакцию. Современная наука научилась делать антитела против практически любых белков — в том числе и против поверхностных клеточных маркеров. Чтобы использовать антитела для определения маркеров, ученые прибегают к еще одной хитрости. Они присоединяют к антителу еще один белок: или фермент, или флуоресцирующий (светящийся) белок. Тогда, если к исследуемым клеткам добавить антитела против поверхностного маркера, связанные с ферментом, потом отмыть лишние антитела и добавить субстрат для фермента, который при расщеплении приобретает какой-нибудь цвет, то клетки, несущие на своей поверхности нужный маркер, окажутся окрашенными, а остальные клетки — останутся бесцветными (рис. 1).

Рисунок 1. Пример выявления онкомаркера HER2 с помощью антител (иммуногистохимия). Коричневые клетки несут на своей поверхности HER2.

Такая модификация выявления маркера называется иммуногистохимией («иммуно» — из-за того, что используют иммунные антитела, «химия» — потому что в методе присутствует химическая реакция расщепления субстрата ферментом, «гисто» — потому что чаще всего такой метод применяют к гистологическим срезам — тонким слайсам исследуемой ткани, которые закреплены на стеклянной подложке).

Другой метод, позволяющий выявлять поверхностные маркеры, называется проточной цитофлуориметрией (fluorescence-activated cell sorting, FACS) [3]. Здесь исследуемые клетки (в виде одноклеточной взвеси) смешивают с антителами, к которым присоединены флуоресцирующие белки. Антитела связываются со своими маркерами-мишенями, a не связавшиеся антитела удаляют. Далее клетки загружают в прибор. Он создает тонкую струю из клеточной суспензии, проходящую через свет лазера буквально по одной клетке. Если на поверхности клетки есть искомые маркеры, то вместе с клеткой в луч лазера попадают и антитела, связавшиеся с маркерами. Происходит возбуждение флуорофора на антителе, и он испускает на своей длине волны свет, который и регистрируется детектором (рис. 2).

Рисунок 2. Общий принцип проточной цитофлуориметрии.

После этого прибор может отклонить эту клетку из струи или в одну сторону, или в другую. Таким образом можно разделить клетки на две группы: с маркером и без. Получается, что прибор ­«знает», есть ли искомые маркеры на каждой из исследуемых клеток, сколько таких клеток, умеет сортировать нужные и ненужные клетки.

Описанные способы позволяют выявлять естественные маркеры — молекулы, которые и до начала исследования присутствовали на поверхности или внутри клеток. Эти методы сильно помогли ученым разобраться в том, чем опухолевые клетки отличаются от нормальных, стволовые клетки — от более зрелых и дифференцированных, и разные ткани — друг от друга.

Искусственные маркеры: внедрить и распознать

У описанных выше методов есть один существенный недостаток: они не позволяют установить родственные связи между клетками. Вот, предположим, у нас есть 100 клеток, и у 12 из них есть маркер А на поверхности. Все эти клетки А для нас будут на одно лицо, как близнецы (рис. 3).

Рисунок 3. Братья-близнецы из фильма «Приключения Электроника».

Мы не сможем сказать, произошли ли все эти 12 клеток от одной материнской и являются ли «близкими родственниками». Или, скажем, можно предположить, что они получились после деления нескольких клеток с исследуемым маркером и являются друг другу двоюродными, троюродными братьями и сестрами, а может быть и вовсе седьмой водой на киселе. Чтобы исследовать родственные связи в клеточной популяции (еще говорят — «исследовать клональный состав популяции» [4]) и следить за тем, как ведет себя потомство отдельных клеток, ученые научились вводить искусственные генетические маркеры в клетки. Делают это несколькими способами. Один из самых продвинутых способов на сегодняшний день — использование специальных вирусов.

Рисунок 4. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) человека, маркированные лентивирусом с зеленым флуоресцентным белком GFP.

собственные данные автора статьи, [4]

Современная генная инженерия достигла таких невиданных высот, что специалисты научились конструировать вирусы с заранее известными, тщательно отобранными для целей исследователей свойствами. Например, можно создать вирус, который способен заражать клетку — проникать через ее оболочку в ядро, — встраиваться в ДНК зараженной клетки, и больше ничего не делать: не создавать новые вирусные частицы, не копировать себя в геноме зараженной клетки, не экспрессировать ни один из вирусных генов. Вместо этого ученые смогли заставить вирус, который встроился в ДНК клетки, экспрессировать нужные белки (например, на этом принципе основана генотерапия). В частности, можно сделать так, что с ДНК вируса экспрессируется флуоресцентный белок [5], и зараженная клетка начинает светиться во флуоресцентном микроскопе (рис. 4).

Вирусы, которые способны направленно доставлять гены в ДНК клетки, стали называть вирусными векторами.

Как ВИЧ помогает ученым

На заметку: именно к этому семейству принадлежит вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). На его основе придуманы многие генетические векторы. Так что, в руках ученых ВИЧ из возбудителя страшной болезни превратился в послушный инструмент исследования.

Введение вектора в клетки для исследования их клонального состава принято называть маркированием клеток. Вы здесь совершенно справедливо спросите: «Позвольте, а где же здесь маркирование? Ну, ввели мы ДНК вируса в ДНК клетки, но дальше-то что?». А я Вам отвечу, что здесь-то и начинается самое интересное! Введенная ДНК действительно может выступать в роли маркера. Здесь есть два варианта: 1) маркером может служить не сама вирусная ДНК, а то место, куда она встроилась; 2) маркер может содержаться в самой вирусной ДНК.

Про то, каким удивительным образом в одном клеточном ядре величиной в несколько микрометров упаковываются молекулы ДНК, длина которых измеряется в метрах, читайте увлекательную статью на «Биомолекуле»: «Организовать геном: запутанная история гипотез и экспериментов» [6].

Рисунок 5. Модель фрактально-глобулярной структуры ДНК. Цветом здесь условно обозначены разные хромосомы.

Соответственно, у одного маленького вируса много возможностей, куда встроиться. В идеале — их бесконечно много, и поэтому найти две клетки, в которых бы вирусы встроились в абсолютно одинаковом месте, — довольно сложно. Еще один важный момент заключается в том, что если зараженная клетка решит поделиться, то обе ее дочерние клетки будут содержать провирус (так называется вирус, который встроился в геномную ДНК) в одном и том же месте генома! Другими словами, генетический маркер — наследуемый признак. Если научиться определять, в какое же именно место генома попал вирус в разных клетках, то можно было бы отличать потомство одной зараженной клетки от другой! И ученые умеют это! Существует несколько методов, позволяющих это сделать, главные из которых — метод саузерн-блоттинга и полимеразная цепная реакция, опосредованная лигированием [7], [8].

Про принцип гибридизации по Саузерну я отсылаю тебя, дорогой читатель, к другой замечательной статье, посвященной описанию важнейших методов молекулярной биологии: «Важнейшие методы молекулярной биологии и генной инженерии» [9]. А о полимеразной цепной реакции расскажет статья «12 методов в картинках: полимеразная цепная реакция» [10].

Оба метода основаны на том, что вследствие случайного характера интеграции вируса в геномную ДНК расстояние от провируса до ближайшего сайта рестрикции будет разным в двух независимо зараженных клетках. Соответственно, если из зараженных клеток выделить ДНК и разрезать ее одной из рестриктаз, то длина фрагмента, содержащего провирус, будет разной у потомства двух разных зараженных клеток, и будет одинаковой у всех клеток, которые произошли в результате деления одной зараженной клетки. Если после рестрикции разделить фрагменты гель-электрофорезом [11], перенести на нитроцеллюлозную мембрану и гибридизовать с короткой последовательностью дезоксирибонуклотидов, комплементарной провирусу (такие олигонуклеотиды принято называть зондами), то на фотобумаге проявится набор полос, который будет одинаковым для клеточного потомства одной клетки и разным — для клеточного потомства нескольких зараженных клеток (рис. 6).

Рисунок 6. Саузерн-блот клеточных клонов, полученных из популяции, зараженной лентивирусным вектором. Каждая дорожка — результат саузерн-блоттинга ДНК из клеточного клона (клеточного потомства одной зараженной клетки). Набор полос в каждой дорожке соответствует продукту гибридизации зонда, комплементарного провирусу, с фрагментами расщепленной ДНК, содержащими провирус. Фрагменты разделены по длине с помощью гель-электрофореза.

собственные данные автора статьи, [4]

Из картинки видно, что на первых трех (и некоторых других дорожках — предлагаю читателю размяться и подсчитать их!) паттерн полос идентичен. Это говорит о том, что ДНК, проанализированная в этих образцах, получена из клеток, произошедших от одной исходно зараженной материнской клетки. Легко также заметить, что дорожка с таинственным названием Р5-4 содержит совершенно другой набор полос. Это означает, что ДНК, использованная здесь, принадлежала другой зараженной клетке. Недостаток такого метода в том, что он не позволяет в явном виде идентифицировать сайт интеграции провируса. Метод позволяет только сравнивать между собой клеточные клоны и судить об их родстве.

Другой метод, который позволяет анализировать сайты интеграции провирусов, — полимеразная цепная реакция, опосредованная лигированием [8]. Это достаточно сложный и многостадийный метод, который включает в себя рестрикцию ДНК, присоединение (лигирование) адаптеров, использование магнитных микрочастиц, ПЦР, электрофорез и секвенирование и заслуживает отдельной статьи. Прошу тебя, мой читатель, поверить мне на слово — этот метод позволяет с точностью до нуклеотида определить место в ДНК, в которое произошла интеграция провируса. С помощью этой методики можно не только различить потомство зараженных клеток между собой, но также судить о том, сколько вирусов проникло в ДНК зараженной клетки, в какие гены произошла интеграция, и не произошло ли изменение их экспрессии в результате внедрения вируса [12], [13].

Ранее я упомянул о том, что в качестве маркера, кроме места интеграции, можно использовать и саму ДНК провируса. Давайте рассмотрим подробнее, как это можно сделать. Здесь нам поможет химический синтез олигонуклеотидов! Дело в том, что в ДНК вируса можно вводить любую информацию: например, ген, кодирующий флуоресцирующий белок или фермент. Правда, тогда все вирусные частицы ничем не будут отличаться одна от другой и приобретут смысл маркеров только тогда, когда попадут в клетку. А почему бы не сделать сами вирусные частицы уникальными? Для этого ученые конструируют лентивирусные векторы, несущие так называемые генетические штрих-коды [14]. Суть заключается в том, что с помощью химического синтеза получают смесь олигонуклеотидов, где в некоторых позициях случайным образом содержится любой из четырех известных дезоксирибонуклеотидов. Дизайн штрих-кода может быть, например, таким:

ATC NNN GGA NNN TAT NNN CGA NNN ATT NNN GTG NNN

Здесь символы N обозначают любой из известных нуклеотидов (А, Т, C или G). Такой штрих-код ничего не кодирует, но он представляет собой смесь нуклеотидов с разными последовательностями. Приведенный штрих-код — на самом деле смесь из 4 18 (или приблизительно 10 11 после несложных, но утомительных математических преобразований) различных олигонуклеотидов! Такая смесь используется для сборки вирусов. На выходе получаются уже не обезличенные вирусы, похожие друг на друга как две капли воды, но целая библиотека вирусов, где каждая вирусная частица несет какой-то из возможных олигонуклеотидов-штрих-кодов. Клетки заражают такой вирусной библиотекой, и каждая зараженная клетка получает в свою ДНК уникальный стабильный наследуемый маркер в виде генетического штрих-кода. Все дочерние клетки будут нести тот же штрих-код (или набор штрих-кодов), который приобрела материнская клетка при заражении. Клеточное потомство двух разных зараженных материнских клеток будет иметь различные штрих-коды. Подобно тому, как штрих-коды на товарах в обычном продуктовом магазине позволяют однозначно идентифицировать и отличить один товар от другого, так генетические штрих-коды позволяют отличить потомство одной зараженной клетки от другой. Если затем из зараженной популяции клеток выделить ДНК и определить все присутствующие в ней штрих-коды с помощью новых методов секвенирования, то можно однозначно установить клональный состав клеточной популяции, проследить за динамикой клонов и выявить те клоны, которые преобладают над другими. После заражения библиотекой лентивирусов со штрих-кодами клеточная популяция становится как будто раскрашенной маркерами с очень-очень-очень разнообразной палитрой [15], примерно вот так (рис. 7):

Рисунок 7. Как выглядела бы клеточная популяция, если бы каждый генетический штрих-код имел свой цвет.

Рисунок 8. Канцелярские принадлежности.

Источник