Что такое идентификация в микробиологии
Идентификация микробов
Полезное
Смотреть что такое «Идентификация микробов» в других словарях:
ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРОБОВ ( — от позднелат. identifico отождествляю), определение видовой или типовой принадлежности микроорганизма на основании изучения культурально морфологич., биохимич., серологич. и патогенных свойств. Культуральные свойства микроорганизмов определяют… … Ветеринарный энциклопедический словарь
идентификация микробов — (от позднелат. identifico отождествляю), определение видовой или типовой принадлежности микроорганизма на основании изучения культурально морфологических, биохимических, серологических и патогенных свойств.Культуральные свойства… … Ветеринарный энциклопедический словарь
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ — исследование, применяемое для выявления патогенных бактерий в материале от больных животных или их трупов, обнаружение микробов в объектах внешней среды, кормах, мясе и т. д. Характер и методика взятия проб, способ пересылки материала при… … Ветеринарный энциклопедический словарь
Бактериологический (культуральный) метод — совокупность методик искусственного культивирования микроорганизмов на питательных средах в целях их идентификации при установлении д за инфекционного заболевания или иного вызванного микробами процесса и определения ряда физиологических св в к… … Словарь микробиологии
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ СРЕДЫ — дифференциально диагностические среды, специальные питательные среды, используемые для идентификации микроорганизмов, обладающих избирательной биохимической активностью по отношению к определённым веществам. В процессе развития микробы с помощью… … Ветеринарный энциклопедический словарь
Микробиологические исследования — находят широкое применение не только в микробиологии и др. областях биологии (например, в цитологии, генетике, биохимии, радиобиологии), но и в медицине, сельском хозяйстве и др. Цель М. и. обнаружение микроорганизмов в воде, воздухе,… … Большая советская энциклопедия
Блохина, Ирина Николаевна — В Википедии есть статьи о других людях с такой фамилией, см. Блохина. В Википедии есть статьи о других людях с именем Блохина, Ирина. Блохина Ирина Николаевна Дата рождения: 21 апреля 1921(1921 04 21) Дата смерти … Википедия
Блохина Ирина Николаевна — (21 апреля 1921 14 апреля 1999) выдающийся учёный, академик Российской академии медицинских наук (РАМН), лауреат Государственной премии СССР, зав.кафедрой Нижегородского Горьковского Университета, директор Горьковского НИИ эпидемиологии и… … Википедия
Ирина Блохина — Блохина Ирина Николаевна (21 апреля 1921 14 апреля 1999) выдающийся учёный, академик Российской академии медицинских наук (РАМН), лауреат Государственной премии СССР, зав.кафедрой Нижегородского Горьковского Университета, директор Горьковского… … Википедия
Ирина Николаевна Блохина — Блохина Ирина Николаевна (21 апреля 1921 14 апреля 1999) выдающийся учёный, академик Российской академии медицинских наук (РАМН), лауреат Государственной премии СССР, зав.кафедрой Нижегородского Горьковского Университета, директор Горьковского… … Википедия
Идентификация микроорганизмов
Смотреть что такое «Идентификация микроорганизмов» в других словарях:
идентификация микроорганизмов — определение принадлежности микроорганизмов к определенному виду, роду и т. д., основанное на изучении комплекса их биологических признаков (морфология, биохимическая активность, антигенные свойства, патогенность для животных и др.) … Большой медицинский словарь
ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРОБОВ ( — от позднелат. identifico отождествляю), определение видовой или типовой принадлежности микроорганизма на основании изучения культурально морфологич., биохимич., серологич. и патогенных свойств. Культуральные свойства микроорганизмов определяют… … Ветеринарный энциклопедический словарь
идентификация микробов — (от позднелат. identifico отождествляю), определение видовой или типовой принадлежности микроорганизма на основании изучения культурально морфологических, биохимических, серологических и патогенных свойств.Культуральные свойства… … Ветеринарный энциклопедический словарь
КУЛЬТУРА МИКРООРГАНИЗМОВ — культура микроорганизмов, популяция клеток микроорганизмов (бактерии, дрожжи, актиномицеты, плесневые грибы), выращенная в жидкой или на плотной питательных средах. Различают чистую и смешанную К. м. Если на питательной среде вырастают… … Ветеринарный энциклопедический словарь
ДНК-ИДЕНТИФИКАЦИЯ — или типирование ДНК, установление генетической индивидуальности любого организма на основе анализа особенностей его дезоксирибонуклеинововой кислоты (ДНК). Получаемый при типировании профиль ДНК, как и отпечатки пальцев, может использоваться для… … Энциклопедия Кольера
вид — основная таксономическая единица, совокупность особей одного генотипа, обладающих хорошо выраженным фенотипическим сходством. Строгое общепринятое определение В. до сих пор не разработано. (Источник: «Микробиология: словарь терминов», Фирсов Н.Н … Словарь микробиологии
Череп — I Череп (cranium) скелет головы, состоящий из мозгового и лицевого (висцерального) отделов. В мозговом отделе выделяют крышу, или свод, и основание черепа. Мозговой отдел образует вместилища для головного мозга, органов обоняния, зрения,… … Медицинская энциклопедия
1: — Терминология 1: : dw Номер дня недели. «1» соответствует понедельнику Определения термина из разных документов: dw DUT Разность между московским и всемирным координированным временем, выраженная целым количеством часов Определения термина из… … Словарь-справочник терминов нормативно-технической документации
Микробиологи́ческая диагно́стика — основана на идентификации возбудителя или выявлении иммунного ответа организма больного на него. Начальным этапом М.д. является отбор материала и транспортировка проб в лабораторию. Вид материала для исследования определяется особенностями… … Медицинская энциклопедия
Медицина — I Медицина Медицина система научных знаний и практической деятельности, целями которой являются укрепление и сохранение здоровья, продление жизни людей, предупреждение и лечение болезней человека. Для выполнения этих задач М. изучает строение и… … Медицинская энциклопедия
Блохина, Ирина Николаевна — В Википедии есть статьи о других людях с такой фамилией, см. Блохина. В Википедии есть статьи о других людях с именем Блохина, Ирина. Блохина Ирина Николаевна Дата рождения: 21 апреля 1921(1921 04 21) Дата смерти … Википедия
ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРОБОВ
ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРОБОВ (позднелат. identificare отождествлять) — определение видовой или типовой принадлежности микробов. И. м.— важнейший этап микробиол, исследования, необходимый для определения этиологии инфекционного заболевания; она имеет большое значение для эпидемиол, анализа вспышек инфекционных заболеваний и проведения эффективных мероприятий по их ликвидации. И. м. также широко используется при сан.-гиг. оценке почвы, воздуха, воды и пищевых продуктов.
И. м. осуществляется путем изучения комплекса морфол., культуральных, биохим., антигенных, патогенных и других свойств данной культуры, что позволяет установить ее идентичность (тождество) типичным представителям, определенного вида (типа) микроорганизмов. Для этих исследований, как правило, необходимо располагать чистой культурой, поскольку присутствие посторонних микробов может послужить поводом для ошибочных заключений.
Выбор методов исследования для И. м. в значительной мере определяется источником выделения микроба (напр., материалом, полученным от больного, из трупа или объектов окружающей среды).
Содержание
Определение свойств микроорганизмов
В идентификации риккетсий (см.) значение имеют изучение их морфологических свойств, особенностей внутриклеточного паразитизма, антигенных свойств и т. д. При идентификации представителей грибков, актиномицетов и простейших значение имеют морфол, особенности возбудителя (см. Актиномицеты, Грибки паразитические, Простейшие). Основными признаками в идентификации микоплазм являются их морфол., культуральные и антигенные свойства (см. Mycoplasmataceae). Бактерии идентифицируют на основе комплексного изучения их морфол., тинкториальных, культуральных, биохим., антигенных, фаголизабельных, бактериоциногенных и патогенных свойств.
Заслуживает внимания предложение некоторых исследователей [Кауэн и Стил (S. Т. Cowan, К. I. Steel), 1961, 1965; Сили и Ван-Демарк (H. W. Seeley, В. I. Van Demark), 1972] использовать в качестве исходного пункта идентификации бактерий окраску по Граму. На первой стадии дифференцирования грамположительных бактерий авторы учитывают форму клетки, кислотоустойчивость, спорообразование, подвижность, продукцию каталазы, оксидазы, отношение к глюкозе, а грамотрицательных бактерий — форму клетки, подвижность, продукцию каталазы, оксидазы и отношение к глюкозе. На последующих стадиях исследования, пользуясь таблицами, характеризующими бактерии, относящихся к определенному роду, находят ключ к определению видов, подвидов и типов.
Морфологические и тинкториальныe свойства
Изучение морфол, и тинкториальных признаков микроба является обычно лишь первоначальной стадией его идентификации. Морфология микроорганизмов изучается путем микроскопии фиксированных и окрашенных препаратов, а также живых неокрашенных микроорганизмов в висячей или раздавленной капле.
Для длительного наблюдения за живыми бактериями применяют специальные камеры (Пешкова, Фонбрюна). Микроскопическое исследование позволяет определить форму, размеры и строение микроорганизмов, их взаимное расположение, подвижность, количество и распределение жгутиков, форму и положение спор, а также образование капсул. Для изучения подвижности берут молодые (не старше 6—8 час.) быстрорастущие бульонные культуры. Жгутики легче обнаруживаются в молодых агаровых культурах, споры, наоборот, в культурах, выращенных в течение нескольких суток, а капсулы — в патол, экссудатах. При микроскопии висячей капли лучше пользоваться темным полем или фазово-контрастным устройством. При этом следует учитывать, что формы и размеры микроорганизмов изменяются в зависимости от особенностей штамма, возраста культуры, состава среды, температуры инкубации и других факторов.
В случаях специфичности морфологии микроба путем микроскопического исследования можно предположительно идентифицировать его. В мед. микробиологии такого рода идентификация обоснована только тогда, когда она соответствует клин, диагнозу. Так, напр., кислотоустойчивые палочки в цереброспинальной жидкости больного с клин, симптомами менингита можно предварительно отнести к туберкулезным микобактериям. Грамотрицательные биполярно окрашивающиеся овоидные палочки в соке лимф, узлов больного с паховыми бубонами в местности, где распространена чума, можно рассматривать предположительно как чумные бактерии.
Культуральные свойства указывают на принадлежность микроба к определенной группе и намечают направление дальнейших исследований в целях его окончательной идентификации. Их определяют путем посева изучаемой культуры на питательные среды (агар, бульон, уколом в желатину и др.). Из культуральных признаков бактерий и грибков важное значение имеют внешний вид и внутреннее строение колоний, формирующихся при высеве культуры на плотные питательные среды. Если микроб не дает роста на обычном мясопептонном агаре, то должна быть применена другая, оптимальная для него среда. Колонии обычно просматривают через 24 часа инкубации при t° 37°, а затем повторно с интервалом в 1 — 3 дня. При описании колоний обращают внимание на их размеры, цвет (пигментообразование), форму, профиль, поверхность, края, плотность. Если бактерии проявляют тенденцию к диссоциации на фазовые варианты (см. Диссоциация бактерий), то их разделяют путем рассева на чашках Петри с питательной средой. При росте на жидких питательных средах отмечают придонность роста, рост в виде пленки или равномерное помутнение среды. В некоторых случаях изучается рост на специальных средах, таких как сыворотка Леффлера, глицериновый картофель, среды, содержащие кровь, и др. Культуральные свойства микроба являются существенным дополнением к его морфол, признакам.
Резистентность микробов к различным факторам окружающей среды
Резистентность микробов к различным факторам окружающей среды используется при И. м., т. к. в ряде случаев микробы значительно отличаются по этому признаку. Так, напр., неспороносные бактерии и вегетативные формы спороносных бактерий чувствительны к температуре и к малым концентрациям антисептиков. Они погибают при t° 60° в течение получаса и в 1% р-ре фенола в пределах 1 часа. Кислотоустойчивые бактерии чувствительны к температуре, но относительно резистентны к дезинфекционным средствам; они погибают при t° 60° в течение получаса, но на холоду противостоят антисептикам часто в течение нескольких часов. Особо высокой устойчивостью обладают споры бактерий (см. Споры, бактерий). Они погибают либо от пара под давлением (при t° 120° в течение получаса) или от высоких концентраций антисептиков, напр, под воздействием 5% фенола в течение нескольких часов. Поэтому при подозрении на образование микробом спор ставят пробы на резистентность к температуре.
Для определенных видов бактерий показательна их устойчивость к нек-рым антибиотикам и химиотерапевтическим препаратам. Так, напр., одним из тестов, позволяющих дифференцировать классический холерный вибрион от вибриона Эль-Тор, а также Proteus mirabilis от других кишечных бактерий, служит способность вибриона Эль-Тор и Proteus mirabilis расти в присутствии полимиксина В (50 ед. в 1 мл и выше).
Особенности физиологии и биохимической активности
При определении биохимической активности микробов учитывают их отношение к кислороду, углекислоте и различным субстратам, оптимальную температуру роста, гемолитическую способность, а также влияние на их рост различных веществ, включая бактериальные факторы роста (см.). По отношению к свободному кислороду микробы обычно делят на строгие аэробы (см.), строгие и факультативные анаэробы (см.). Поэтому для выделения и идентификации возбудителя применяют специальные методы и питательные среды, способствующие росту только аэробных, факультативно-аэробных или анаэробных представителей.
Для большинства патогенных микробов оптимальная температура культивирования 37° (см. Бактерии).
Гемолитическая активность микробов определяется при выращивании их в чашках с кровяным агаром или же путем прибавления различных разведений бульонной культуры к взвеси отмытых эритроцитов.
Изучение влияния на рост бактерий различных биол, субстратов и хим. соединений (кровь, сыворотка, глюкоза, нитраты, соли желчных к-т, витамины, аминокислоты и др.) часто имеет значение для дифференциации этой группы микроорганизмов.
Для И. м. большое значение имеют особенности ферментативной активности микробов, выявляемые на средах, содержащих сахара и спирты, белковые субстраты и жиры (липолитические свойства), что позволяет выявить тончайшие различия между близкородственными микробами. Важно также определение редуцирующих свойств бактерий и их способности образовывать индол, аммиак и сероводород, использовать цитраты и тартраты (см. Дифференциально-диагностические среды).
Антигенная структура и отношение к бактериофагу
Антигенная структура и отношение к бактериофагу и бактерицинам изучаются на завершающем этапе И. м. Выявление антигенного строения микробов осуществляют при помощи различных серол, реакций, напр, реакции агглютинации (см.), реакции связывания комплемента (см.) и др.
Если в развернутой реакции агглютинации испытываемый микроб агглютинируется до титра иммунной сыворотки или половины титра, то на практике его можно считать принадлежащим к тому виду (типу), каким обозначена данная сыворотка. Для полной идентификации выделенный возбудитель должен агглютинироваться до титра иммунной сывороткой, приготовленной против эталонного микроба: испытуемый микроб должен адсорбировать из этой сыворотки все агглютинины. С другой стороны, эталонный микроб должен агглютинироваться до титра сывороткой, приготовленной против изучаемого микроба, и также адсорбировать из этой сыворотки все агглютинины. Иными словами, должна быть полная перекрестная агглютинация и перекрестная адсорбция между обеими сыворотками и обоими микробами. Реакция агглютинации иногда дополняется или заменяется реакцией преципитации (см.), а также реакцией непрямой гемагглютинации (с эритроцитами, нагруженными антителами). Серол, метод обнаруживает тончайшие различия между родственными микробами. Он часто является единственно доступным методом для дифференцирования подвидов или типов данного вида.
Широкое применение в лабораторной практике получили агглютинирующие монорецепторные сыворотки для идентификации сальмонелл, шигелл и других микробов. Весьма эффективно также применение метода иммунофлюоресценции (см.), который позволяет быстро (1 — 2 часа) осуществить И. м.
Чувствительным методом И. м. является типирование идентифицирующей культуры бактериофагом (см.). Этот метод используется, напр., при изучении брюшнотифозной палочки (см. Vi-брюшнотифозные фаги), т. к. позволяет распознавать фаготип в пределах вида. Специфические фаги применяют для дифференцирования шигелл, холерных вибрионов от холероподобных, классического холерного вибриона от вибриона Эль-Тор, чумной палочки от бактерий псевдотуберкулеза и других бактерий.
Для дифференцирования некоторых бактерий в пределах вида используют феномен бактериоциногении (см.), а также испытание чувствительности бактерий к бактерицинам различных типов (колицины, вибриоцины, пестицины, дифтериоцины и др.). Колицинотипирование нашло широкое применение для определения принадлежности выделенной культуры шигелл к определенному колицинотипу.
Патогенность для животных
Патогенность микробов обычно определяют в опытах на белых мышах, морских свинках и кроликах. Животных заражают подкожно, внутрикожно, внутримышечно, внутривенно, интраперитонеально, перорально, интраназально или интрацеребрально (см. Биологическая проба).
При изучении патогенных микроорганизмов иногда требуется определить, образуют ли они экзотоксины. С этой целью на чувствительных животных испытывается фильтрат бактериальной культуры, выращенной в течение определенного срока на соответствующей жидкой среде. Экзотоксины высокотоксигенных бактерий (дифтерийной палочки, столбнячной бациллы, ботулинической бациллы и др.) вызывают заболевание животных с характерной клин, картиной и последующую их гибель с типичными патол ого анатомическими изменениями. Для обнаружения некоторых микробных экзотоксинов применяют культуры чувствительных к ним тканей, а также куриные эмбрионы. Нейтрализация экзотоксинов специфическими антитоксинами играет существенную роль при И. м.
Библиография: Красильников Н. А. Определитель бактерий и актиномицетов, М.—Л., 1949, библиогр.; Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней, под ред. К. И. Матвеева, М., 1973; Тим а ков В. Д. и Гольдфарб Д. М. Основы экспериментальной медицинской бактериологии, М., 1958, библиогр.; Bergey’s manual of determinative bacteriology, ed. by R. E. Buchanan a. N. E. Gibbons, Baltimore, 1975, bibliogr.; Cowan S. T. a. Steel K. J. Manual for the identification of medical bacteria, Cambridge, 1974; Identification methods for microbiology, ed. by В. M. Gibbs a. F. A. Skinner, v. 1—2, L.— N. Y., 1966—1968; International code of nomenclature of bacteria, ed. by S. P. Lapage a. o., Washington, 1975; M e у n e 1 1 G. G. a. M e y n e 1 1 E. Theory and practice in experimental bacteriology, Cambridge, 1970, bibliogr.; Nomura M. Colicins and related bacteriocins, Ann. Rev. Microbiol., v. 21, p. 257, 1967, bibliogr.; W i 1-s o n G. S. a. M i 1 e s A. A. Topley and Wilson’s principles of bacteriology and immunity, v. 1—2, L., 1964.
Глава 5. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
Цель идентификации микроорганизмов – определение принадлежности отдельных их популяций к тем или иным видам, родам, семействам и т.д. Процесс идентификации микроорганизмов является одним из самых важных и трудоемких этапов проведения биологических исследований.
Методы идентификации различных микроорганизмов разрабатывались и совершенствовались микробиологами и бактериологами на протяжении многих лет, и сегодня эти методы активно используются в науке, медицине, фармацевтике, промышленном производстве (в том числе продуктов питания).
Разработанные ранее методы представляют собой основу для исследователей и являются базисом большого количества методик, которые позволяют определять следующие свойства бактерий;
Идентификация любых бактерий с использованием метода посева на питательные среды невозможна без выделения чистой культуры. Это требование в микробиологии связано с тем, что присутствие микробов других родов и семейств во время проведения бактериологических исследований всегда существенно искажает результаты, вследствие чего исследователь делает неверные заключения.
Проблема получения чистой культуры и объективной идентификации микроорганизмов всегда актуальна для микробиологии, микологии и вирусологии. Разработанные методы идентификации микроорганизмов делят на рутинные и современные. Предпочтение отдается методам идентификации, которые выполняются за относительно короткий срок (часы) и отличаются высокой степенью объективности и точности.
Изучение генотипа микроорганизмов стало возможным в результате успешного развития молекулярной биологии и привело к возникновению геносистематики. Исследование генотипа, основанное на анализе нуклеиновых кислот, в принципе позволяет построить со временем естественную (филогенетическую) систему микроорганизмов.
Рутинные методы основаны на получении чистой культуры и изучении ее разнообразных свойств: морфологических, культуральных, биохимических, антигенных и биологических. При этом затрачивается не только множество компонентов реакций и питательных сред, но и, что очень важно при санитарно-микробиологической оценке пищевых продуктов, времени.
При идентификации микроорганизмов, например дрожжей, используют метод нумерической таксономии. Он основан на следующей идее: считаются равноценными различные фенотипические признаки, поддающиеся учету, что позволяет количественно выразить таксономические дистанции между организмами в виде отношения числа положительных признаков к общему числу изученных признаков. Путем количественной оценки возможно большего числа (обычно не менее 100) фенотипических признаков, которые подбирают так, чтобы их варианты были альтернативными и могли обозначаться знаками «минус» или «плюс», определяется сходство между двумя исследуемыми организмами. Степень сходства устанавливается на основании количества совпадающих признаков и выражается в виде коэффициента сходства.
Значение коэффициента сходства может меняться от 0 до 1. Коэффициент 1 означает полную идентичность, а 0 – полное несходство. Оценки комбинаций признаков производят с помощью компьютера. Полученные результаты представляют в виде матрицы сходства и/или в виде дендрограммы. Нумерическая таксономия может применяться при оценке сходства между таксонами микроорганизмов только невысокого ранга (роды, виды). Она не позволяет делать непосредственные выводы относительно генетического родства микроорганизмов, однако в известной степени отражает их филогенетические свойства. Так, установлено, что фенотипические признаки бактерий, поддающиеся изучению в настоящее время, отражают от 5 до 20% свойств их генотипа.
Современные методы идентификации не требуют многочисленного квалифицированного персонала и большого количества времени. Некоторые из них не требуют получения чистых культур. Они в свою очередь делятся на ручные и автоматические.
5.1. РУЧНЫЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ
К ручным методам идентификации микроорганизмов относят: систему индикаторных бумажек, наборы мультимикротестов, метод хроматографии.
Ручные тесты, применяемые для индикации и идентификации микроорганизмов, важны для медицинской микробиологии и широко используются в санитарной микробиологии. Их постановка требует соблюдения стандартных условий проведения.
В последние десятилетия разработаны различные тест-системы: API-20E, Enterotube, Mycotube, Patho-Tec, СИБ, ПБДЭ и др. Система Enterotube представляет собой пластиковую камеру с 12 ячейками, содержащими окрашенные диагностические среды. Засев всех сред производится поступательно-вращательными движениями через камеру петли с посевным материалом. Инкубацию проводят в течение 24 ч при 37°С. О положительном или отрицательном результате теста судят по изменению цвета среды, разрыву агара (тест на газообразование) или после введения специальных реактивов (тест на образование индола, реакция Вогес–Проскауэра). Каждый признак обозначают определенной цифрой, поэтому полученные данные можно ввести в компьютер с соответствующей программой и получить ответ о таксономическом положении исследуемого штамма.
Система индикаторных бумажек (СИБ). Она представляет собой диски, пропитанные различными питательными средами. Эти специальные диски можно вносить в пробирки с бактериями или предварительно вкладывать в лунки планшетов, в которые вносят исследуемые культуры микроорганизмов. В частности, используют наборы дисков фирм Minitek (Enterobacteriaceae) и Minitek (Neisseria) для идентификации энтеробактерий и нейссерий. Способ позволяет получить результаты через 4 ч инкубации при 37°С.
Наборы мультимикротестов. Они представляют собой планшеты из пластика с лунками. В лунках располагаются питательные субстраты с индикаторами продуктов метаболизма бактерий. В лунки помещают суспензии изучаемых бактерий и термостатируют. Для идентификации гемофилов, энтеробактерий, листерий, стафилококков и др. используют тесты RapID NH, которые позволяют получить ответ не позднее 4–8 ч.
Серологические методы идентификации бактерий. С их помощью, используя специфические антитела, выявляют бактериальные антигены. Чаще всего в настоящее время пользуются методами ИФА-твердофазным и латекс-агглютинации.
Иммуномагнитное разделение. В основу метода положено использование активированных парамагнитных частиц размером порядка 2–3 мкм, которые покрываются антителами путем выдерживания при пониженной температуре до 24 ч. После инкубации несвязавшиеся антитела отмывают. После такой обработки частицы, покрытые антителами, добавляют к суспендированной пробе продукта питания, предположительно содержащей антигены, к которым специфичны антитела частиц (токсины или целые клетки в случае грамотрицательных бактерий). После добавления частиц пробу инкубируют при нормальной температуре от нескольких минут до нескольких часов, чтобы антитела связались с антигеном. Образованные комплексы собирают магнитом, после чего элюируют антиген и подсчитывают количество связавшихся частиц. Элюированный и сконцентрированный антиген может быть подвергнут другим методам анализа. Так, в одном из исследований иммуномагнитное разделение было сопряжено с проточной цитометрией для установления присутствия в пробе одного из штаммов Е. coli. После отмывки от парамагнитных частиц клетки были помечены флуоресцентными антителами, что позволило подсчитать их количество с помощью проточной цитометрии. Этот метод обладает чувствительностью и позволяет обнаружить примерно 10 КОЕ в пробе говяжьего фарша.
Хроматографические методы. С целью индикации и идентификации микроорганизмов нередко используют хроматографические методы. В объектах исследования определяют химический состав клеточной стенки и некоторые метаболиты микроорганизмов, причем как промежуточные, так и уникальные. Чаще всего у бактерий определяют короткоцепочечные жирные и тейхоевые кислоты, миколевую кислоту, используя метод газожидкостной хроматографии.
Нередко пользуются тонкослойной хроматографией. Содержание этих веществ у различных родов бактерий постоянное, и это явление позволяет идентифицировать виды.
Различия в составе липидов используют для идентификации бактерий на уровне рода и даже вида. Однако этот метод имеет определенные ограничения, поскольку содержание жирных кислот в клетках может зависеть от условий культивирования и возраста культуры.
В систематике некоторых бактерий учитывается состав хинонов и других переносчиков электронов, а также пигментов.
Важная информация о взаимном родстве бактерий может быть получена при изучении клеточных белков – продуктов трансляции генов. На основании изучения мембранных, рибосомных, суммарных клеточных белков, а также отдельных ферментов сформировалось новое направление – белковая таксономия. Спектры рибосомных белков относятся к числу наиболее стабильных и используются для идентификации бактерий на уровне семейства или порядка. Спектры мембранных белков могут отражать родовые, видовые и даже внутривидовые различия. Однако характеристики химических соединений клетки не могут использоваться для идентификации бактерий изолированно от других данных, описывающих фенотип, поскольку нет критерия оценки значимости фе-нотипических признаков.
5.2. МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Методы выявления РНК и ДНК возбудителей нашли широкое применение в основном при диагностике инфекций. В настоящее время используются тест-системы для распознавания таких видов и групп бактерий, как хламидии, микобактерии, энтерококки, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae типа b, стрептококки группы В.
Метод сравнения геномов по составу основания ДНК. Как известно, ДНК содержит четыре азотистых основания: аденин (А), тимин (Т), гуанин (Г), цитозин (Ц). По правилам спаривания оснований А = Т и Г = Ц, но молярное отношение (Г + Ц) : (А + Т) варьирует у разных видов и может служить таксономической характеристикой.
Поскольку число водородных связей между основаниями в парах ГЦ больше, чем между основаниями в парах AT, о ГЦ-содержании судят по «температуре плавления» ДНК, т.е. по температуре, при которой происходит разрыв водородных связей, соединяющих цепи ДНК. Разделению цепей сопутствует увеличение оптической плотности, которую измеряют спектрофотометром при А = 260 нм (максимум поглощения ДНК). По мере нагревания образца ДНК поглощение возрастает, а когда ДНК становится одноцепочечной, кривая поглощения достигает плато.
Каждый бактериальный вид ДНК содержит характерное среднее количество ГЦ, и если нуклеотидный состав ДНК у двух сравниваемых микроорганизмов существенно отличается (10–15%), то говорят об их принадлежности к различным таксономическим группам. Однако отсутствия существенных отличий в количестве ГЦ у двух видов бактерий недостаточно для заключения о тождестве этих бактерий: необходимо доказать высокое фенотипическое сходство обоих видов или применить другие генетические методы.
Гибридизация нуклеиновых кислот. В основу метода положена способность нуклеиновых кислот соединяться с комплементарными фрагментами искусственных нитей ДНК/РНК, названная гибридизацией. Искусственные нити метят изотопами или ферментами (пероксидазой или щелочной фосфатазой). Затем образец исследуют в ИФА.
Метод гибридизации нуклеиновых кислот на твердой основе и его сэндвич-модификация распространены больше. В качестве твердой основы служат мембраны из нитроцеллюлозы или нейлона. Не связавшиеся реагенты удаляют многократным отмыванием.
Метод генных зондов. Его используют для идентификации бактерий. От обычной ДНК–ДНК гибридизации этот способ отличается использованием не тотальной ДНК, а ее определенного фрагмента (зонда), содержащего известный ген (генетический маркер). Предварительно создают «банк генов» изучаемой бактерии. С этой целью бактериальную ДНК расщепляют эндонуклеазами, фрагменты ДНК разделяют электрофоретически, методом трансформации определяют их генетические характеристики, отбирают нужный фрагмент ДНК и при помощи лигазы включают в плазмиду, которая служит вектором. Плазмиду с интегрированным известным геном вводят в какой-либо бактериальный штамм, обычно достаточно легко культивируемый. Получают большое количество биомассы, содержащей ДНК-зонд. Выделяют плазмидную ДНК, метят ее радиоактивным изотопом, а затем гибридизируют с ДНК изучаемой бактерии. Методом ауторадиографии выявляют относительную частоту гибридизации маркера с изучаемой ДНК и по этому показателю судят о генетическом родстве известной (бактерии – донора ДНК) и исследуемой бактерий.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Сущностью реакции является амплификация, т.е. увеличение числа копий строго определенных фрагментов молекул ДНК in vitro. Амплифицируемый участок именуют амплификоном.
При синтезе ДНК праймеры физически встраиваются в цепь новосинтезирующихся молекул ДНК, и каждая из вновь синтезированных с помощью одного из праймеров молекул ДНК может служить матрицей для синтеза комплементарной ДНК с помощью другого праймера.
Продолжительность реакции определяется числом циклов, необходимых для синтеза ДНК-амплификаторов в количестве, достаточном для дальнейшего исследования или последующей индикации.
Индикация может быть произведена известными способами: электрофорезом в агарозе с окрашиванием бромистым этидием, гибридизацией с изотопно или неизотопно мечеными генными зондами, непосредственным колориметрическим, флуорометриче-ским, радиоизотопным определением при использовании в системе ПЦР меченых предшественников синтеза нуклеиновых кислот.
Основные компоненты ПЦР:
Используется также аплификатор – прибор для проведения реакции в автоматическом режиме, обеспечивающий поддержку в реакционной смеси заданной температуры в течение заданного времени.
Технология идентификации ДНК-содержащих микроорганизмов выглядит следующим образом.
В ПЦР любая из вновь синтезированных цепей ДНК служит матрицей для синтеза молекул ДНК, соответствующих по длине и последовательности участку ДНК, выбранному для амплификации.
Подготовка пробы материала (выделение ДНК и РНК) должна проводиться в условиях, исключающих перекрестное загрязнение исследуемых проб выделяемыми нуклеиновыми кислотами. Для этого необходимо использовать чистые перчатки, одноразовые пробирки и наконечники к автоматическим пипеткам, УФ-излучение (для обработки помещений и рабочих поверхностей столов и приборов).
Индикация РНК-содержащих вирусов включает следующие этапы.
Анализ с помощью микроматриц. Простейшая микроматрица является твердым носителем (нейлоновая мембрана, стеклянный слайд или кремниевая пластинка), на который нанесены небольшие количества одноцепочечной ДНК (оцДНК) различных известных видов бактерий. Когда на микроматрицу наносится оцДНК, если на матрице имеются комплементарные ей цепи, происходит гибридизация. Анализ при помощи метода ДНК-микроматрицы для микроорганизмов проходит через этапы подготовки зондов, гибридизации и анализа результатов.
На настоящий момент на одной микроматрице помещается от нескольких сотен до нескольких тысяч проб оцДНК различных видов микроорганизмов. При исследовании патовариантов Xanthomonas использовали микроматрицу с 47 пробами для фингер-принтинга 14 близкородственных штаммов. Этим методом были выявлены однозначные различия между штаммами.
Для определения количественного и видового состава бактериального сообщества без культуральной изоляции можно использовать пробы из последовательности 16S-РНК. Очевидно, что метод микроматриц представляет собой отличный инструмент для определения видов бактерий и биотипирования. Микроматрицы производятся множеством коммерческих предприятий. Среди производимых микроматриц существуют ДНК-, РНК- и белковые микроматрицы, причем последние находят широкое применение.
5.3. АВТОМАТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ
Системы распознавания с использованием специальных приборов позволяют за сравнительно короткое время определить вид микроорганизма, а также его чувствительность/устойчивость к антимикробным препаратам.
Наибольшей популярностью пользуются автоматические системы идентификации микроорганизмов типа Microscan и Vitek.
Система Microscan. Данная система идентификации бактерий основана на явлениях турбидиметрии, колориметрии и флуоресценсии. Система включает ряд пластиковых планшетов, в которые помещены биохимически активные субстраты. В основу распознавания грамотрицательных бактерий положено свойство комплекса антиген + антитело испускать «холодное» свечение благодаря искусственной адсорбции на антителах, светящихся в УФ-лучах, специальных белков – флуорохромов. Время анализа – 2 ч. Гемо-филы, анаэробы и дрожжи идентифицируются методом, основанным на иммунохроматографии. Концентрацию антибиотиков определяют с учетом оптической плотности исследуемого субстрата. Система оборудована компьютером и программным обеспечением.
Система Vitek. Здесь используют планшеты. Суспензию бактерий определенной концентрации вносят в лунки. Распознавание микроорганизмов основано на турбидометрии раствора в лунке. Время анализа — от 4–8 до 18 ч. Система оборудована компьютером и программным обеспечением.
Биосенсоры – оптоволоконные методы. Оптическим волокном называют волновод, выполненный из стекла или полимеров и проводящий свет за счет полного внутреннего отражения. В оптоволоконном биосенсоре для улавливания биологической реакции и преобразования ее в различимый оптический сигнал используют оптический или электронный преобразователь.
Оптоволоконный биосенсор представляет собой клиновидный оптоволоконный зонд, покрытый изнутри специфическими антителами. Свет полупроводникового лазера проходит через всю систему оптических волокон и выходит на ее конце в виде исчезающей волны. Когда с антителами на конце связывается флуоресцентно меченый антиген, исчезающая волна взаимодействует с ним, испуская флуоресцентный сигнал во всех направлениях, в том числе и внутрь световода – к сенсорной системе. В качестве флуоресцентной метки используют флуоресцентные красители, такие как Су5.
В оптоволоконной системе поверхностного плазменного резонанса антитела закреплены на поверхности тонкой металлической пленки, расположенной на отражающей поверхности оптически прозрачного стеклянного световода. Когда сквозь волновод проходит видимый или инфракрасный свет, он отражается от металлической пленки. Взаимодействие отраженного света с электронами на поверхности металла и резонансный эффект вызывают сильное поглощение, причем оно тем сильнее, чем выше концентрация комплексов антиген–антитело на поверхности металлической пленки. Чем больше комплексов образовалось, тем длиннее поглощаемые волны.
Оптоволоконный биосенсор применяли для установления наличия Е. coli 0157:Н7 в говяжьем фарше. При использовании двух световодов была достигнута пороговая чувствительность 9 × 10 и 5,2 × 10 КОЕ/г. Результаты были получены в течение 25 мин с момента подготовки образца. При анализе использовали два типа антител и флуоресцентный краситель Су5. Эта же система использовалась для определения L. monocytogenes; инокулят имел концентрацию менее 10 КОЕ/мл и подвергался 20-часовому обогащению. Результаты с биосенсора были получены за 20–45 мин.
Оптоволоконный биосенсор использовали для определения стафилококкового энтеротоксина В в мясе и молоке. Результаты получали в течение 5 мин при использовании одного антитела и в течение 8 мин – при использовании двух. Пороговая чувствительность составила 10 нг/мл.
Метод микрокалориметрии. Метод основан на измерении энтальпии, которая изменяется вследствие метаболической активности растущих микроорганизмов, так как производство тепла тесно связано с физиологической активностью клетки. Исследования проводятся в дискретных или проточных микрокалориметрах.
Изменения температуры, измеряемые с помощью биологических установок, происходят в результате катаболической активности клеток. Чаще всего в пищевой микробиологии применяют установку, обладающую чувствительностью 0,01 кал/ч при объеме пробы 10 мл. Результаты микрокалориметрии зависят от вида микроорганизма, размера инокулята, субстратов и других параметров. Ученые при помощи этого метода успешно идентифицировали промышленные штаммы дрожжей. Для этой цели успешно применяется проточная микрокалориметрия.
В процессе измерений микрокалориметр находится в проточном калориметрическом сосуде. С использованием специальной среды, содержащей семь сахаров, были построены термограммы для девяти молочнокислых бактерий (родов Enterococcus, Leuconostoc и Lactobacillus), которые различаются между собой в степени, достаточной для того, чтобы рекомендовать этот метод для их идентификации. Все культуры выращивались при 37°С (кроме культуры S. Cremoris, выращивавшейся при температуре 30°С), результаты были получены в течение 24 ч.
Метод использовали при определении бактериального заражения консервированных продуктов для разделения видов рода Enterobacteriaceae, определения наличия S. aureus и бактериального заражения говяжьего фарша. При установлении присутствия S. aureus результаты для начальной концентрации 1–10 клеток на 1 мл были получены за 2 ч. При начальной концентрации 2 клетки/мл для получения результатов потребовалось 12–13 ч.
Проточная калориметрия использовалась для определения жизнеспособности восстановленных замороженных клеток S. cerevisiae в течение 3 ч после оттаивания.
При использовании метода для анализа мясного фарша пик производства тепла фиксируется через 24 ч после начала измерения при концентрации бактерий 1–10 КОЕ/г. Результаты микрокалориметрии хорошо коррелируют с результатами прямого подсчета колоний. При концентрации организмов 10 КОЕ/г измеримая скорость производства тепла получается через 6 ч и достигает пика через 10 ч после начала измерения.
Контрольные вопросы и задания