Что такое микроядерный тест
Что такое микроядерный тест
МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЯ ПО ВОЗДЕЙСТВИЮ ХИМИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ НА ОРГАНИЗМ ЧЕЛОВЕКА
Микроядерный тест на клетках млекопитающих in vitro
Methods of testing the impact of chemicals on a human hazard. In vitro mammalian cell micronucleus test
Дата введения 2015-06-01
Предисловие
Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила, рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным унитарным предприятием «Всероссийский научно-исследовательский центр стандартизации, информации и сертификации сырья, материалов и веществ» (ФГУП «ВНИЦСМВ»); Техническим комитетом по стандартизации N 339 «Безопасность сырья, материалов и веществ» Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии документа, указанного в пункте 5
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 мая 2014 г. N 67-П)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97
Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Минэкономики Республики Армения
Госстандарт Республики Беларусь
Госстандарт Республики Казахстан
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 сентября 2014 г. N 1233-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32635-2014 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июня 2015 г.
5 Настоящий стандарт идентичен международному документу OECD Test N 487:2010* «Микроядерный тест на клетках млекопитающих in vitro» («In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test», IDT).
Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного документа для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5 (подраздел 3.6)
7 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Сентябрь 2019 г.
Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.
В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге «Межгосударственные стандарты»
Введение
В дополнение к использованию МЯТ для идентификации индуцирующих микроядра химических веществ, цитокинезный блок, иммунохимическое мечение кинетохоров или гибридизация с центромерными/теломерными зондами [флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)] позволяют получить информацию по механизмам хромосомных нарушений и образования микроядер [6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17]. Процедуры мечения и гибридизации можно использовать в случаях, когда имеется повышение образования микроядер и исследователь хочет выяснить, является ли это возрастание результатом кластогенных и/или анеугенных событий.
Микроядра представляют собой нарушения хромосом, которые передаются дочерним клеткам, тогда как аберрации хромосом, анализируемые в метафазных клетках, могут не передаваться. Поскольку выявление микроядер в интерфазных клетках достаточно объективно, сотрудникам лабораторий необходимо определить прошла или не прошла клетка клеточное деление и как много клеток содержит микроядра. В результате анализ препаратов проводится относительно быстро и может быть автоматизирован. На практике это позволяет анализировать тысячи, а не сотни клеток на экспериментальную точку, увеличивая силу метода. Наконец, поскольку микроядра могут образовывать отставшие хромосомы, возникает возможность выявлять агенты, индуцирующие анеуплоидию, что трудно оценивать в стандартном тесте на хромосомные аберрации (например, Руководство OECD 473 [18]). Однако МЯТ не позволяет выявлять вещества, индуцирующие полиплоидию, от веществ, которые индуцируют кластогенность, без специальных методик, таких как FISH.
МЯТ является методом in vitro, который проводится на культивируемых клетках человека и грызунов. Тест дает полное основание исследовать хромосомные нарушения in vitro, поскольку выявляет как анеугены, так и кластогены.
МЯТ надежен и эффективен в различных типах клеток как в присутствии, так и отсутствии ЦХВ. Имеется большое количество данных, показывающих приемлемость МЯТ при использовании различных линий клеток грызунов (СНО, V79, CHL/IU и L5178Y) и лимфоцитов человека [19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32]. Они включают Международное исследование по валидации теста, координируемое the 
Francaise de Toxicologie 
(SFTG) [19, 20, 21, 22, 23] и доклады Международных совещаний по генетическому тестированию [5, 17]. Все приемлемые данные были также повторно оценены в weight-of-evidence ретроспективном валидационном исследовании Европейского центра по валидизации альтернативных методов (ECVAM) Европейской комиссии (ЕС). Метод тестирования был рекомендован как научно обоснованный ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) [33, 34, 35]. Имеются данные по использованию клеточной линии лимфобластных клеток человека ТК6 [36], HepG2 клеток [37, 38] и первичных эмбриональных клеток сирийского хомячка [39], хотя они не проходили валидизационное исследование.
1 Область применения
Тесты in vitro обычно требуют использования экзогенного источника метаболической активации, за исключением клеток, которые метаболически компетентны в отношении исследуемых соединений. Система метаболической активации не может полностью воспроизводить условия, присутствующие у млекопитающих in vivo. Следует тщательно избегать условий, которые могут привести к результатам, не отвечающим реальной мутагенности. Позитивные результаты, не отвечающие реальной мутагенности, могут возникать вследствие изменения pH, осмотической концентрации, высокого уровня токсичности [41, 42]. Если исследуемое вещество вызывает изменение pH среды во время введения в культуру, pH должна быть скорректирована, предпочтительно забуферив исходный раствор. Таким образом, все объемы при всех концентрациях и все контроли будут иметь одинаковую pH.
Для анализа индукции микроядер необходимо, чтобы митозы были как в опытных, так и контрольных культурах. Для анализа микроядер наиболее информативной является стадия, при которой клетки прошли один митоз во время или после воздействия исследуемого вещества.
2 Термины и определения
2.1 анеуген (aneugen): Любое соединение или процесс, которые, взаимодействуя с компонентами цикла деления митотических и мейотических клеток, приводят к анеуплоидии в клетках или организмах.
2.2 анеуплоидия (aneuploidy): Любое отклонение от нормального диплоидного (или гаплоидного) числа хромосом на одну или более хромосом, но не на полный набор хромосом (полиплоидия).
2.3 апоптоз (apoptosis): Запрограммированная клеточная гибель, характеризующаяся серией этапов, ведущих к дезинтеграции клеток в мембранно-связанные частицы, которые затем элиминируются фагоцитозом или выбросом.
2.4 генотоксический (genotoxic): Общий термин, охватывающий все типы повреждений ДНК или хромосом, включающий разрывы, аддукты, перестройки, мутации, хромосомные аберрации и анеуплоидию. Не все типы генотоксических эффектов приводят к мутациям или стабильным хромосомным нарушениям.
2.5 индекс пролиферации при цитокинетическом блоке; CBPI (Cytokinesis-Block Proliferation index; CBPI): Доля клеток второго деления в обработанной популяции относительно контроля без обработки (см. формулы в приложении А).
2.6 индекс репликации; Rl (Replication Index; RI): Доля завершенных циклов клеточного деления в обработанных культурах по отношению к культурам без обработки в течение периода экспозиции и восстановления (см. формулы в приложении А).
2.7 интерфазные клетки (Interphase cells): Клетки не в стадии митоза.
2.8 кинетохор (kinetochore): Белок-содержащая структура, которая расположена в центромере хромосомы, с которой во время клеточного деления связаны волокна веретена, позволяющие точно расходиться дочерним хромосомам к полюсам дочерних клеток.
2.9 клеточная пролиферация (cell proliferation): Увеличение числа клеток в результате митотического деления клеток.
2.10 кластоген (clastogen): Любое соединение или процесс, которые вызывают структурные хромосомные аберрации в популяции клеток или организмов.
2.11 микроядра (micronuclei): Небольшие ядерные образования, отделенные от основного ядра клетки, образовавшиеся во время телофазы митоза или мейоза в результате отставания хромосомных фрагментов или целых хромосом.
2.12 митоз (mitosis): Деление клеточного ядра, обычно подразделяющееся на профазу, прометафазу, метафазу, анафазу и телофазу.
2.13 митотический индекс (mitotic index): Отношение числа клеток в метафазе к общему числу клеток в наблюдаемой клеточной популяции; показатель клеточной пролиферации в данной популяции.
2.14 мутагенный (mutagenic): Образование наследуемых изменений последовательности пар оснований в ДНК или структуры хромосом (хромосомные аберрации).
2.15 нерасхождение (non-disjunction): Нарушение расхождения парных хроматид и правильной сегрегации при образовании дочерних клеток, приводящее к аномальному числу хромосом в дочерних клетках.
2.16 относительное возрастание количества клеток; RICC (Relative Increase in Cell Count; RICC): Метод измерения цитотоксичности в методиках, при которых не используется ЦХВ (см. формулы в приложении А).
2.17 относительное удвоение популяции; RPD (Relative Population Doubling; RPD): Метод измерения цитотоксичности в методиках, при которых не используется ЦХВ (см. формулы в приложении А).
2.18 полиплоидия (polyploidy): Численные нарушения хромосом в клетках или организмах, затрагивающие полный набор(ы) хромосом, в противоположность нарушениям по одной или нескольким хромосомам (анеуплоидия).
2.19 пролиферативный индекс; PI (Proliferation Index; PI): метод измерения цитотоксичности в методиках, при которых не используется ЦХВ (см. формулы в приложении А).
2.20 центромера (centromere): Участок ДНК хромосомы, где две хроматиды соединяются вместе и в котором оба кинетохора соединяются друг с другом.
2.21 цитокинез (cytokinesis): Процесс клеточного деления сразу после митоза, формирующий дочерние клетки, каждая из которых содержит одно ядро.
2.22 цитостатичность (cytostasis): Ингибирование роста клеток (см. формулы в приложении А).
2.23 цитотоксичность (cytotoxicity): Вредные эффекты на структуру или функцию клеток, в конечном счете приводящие к гибели клетки.
3 Принцип исследования
Культуры клеток человеческого или животного происхождения обрабатывают исследуемым веществом как без, так и в присутствии экзогенного источника метаболической активации за исключением клеток с адекватными особенностями метаболизма. Во все тесты включают контроли с растворителем/разбавителем и позитивные контроли.
Во время и после воздействия исследуемым веществом клетки должны расти такой период времени, который достаточен для формирования из хромосомных нарушений и нарушений веретена деления микроядер в интерфазных клетках. Для индукции анеуплоидии вещество должно обычно присутствовать во время митоза. Микроядра анализируют в фиксированных и окрашенных интерфазных клетках. Идеально, микроядра следует анализировать только в тех клетках, которые закончили митоз во время экспозиции исследуемого вещества или в течение постэкспозиционного периода, если таковой используется. В культурах, которые обрабатывают блокатором цитокенеза, это достигается при анализе двуядерных клеток. В отсутствии блока цитокинеза важно показать, что анализируемые клетки прошли клеточное деление во время или после воздействия исследуемым веществом. Для всех протоколов важно показать, что пролиферация клеток была как в контрольных, так и опытных культурах. Степень индуцированных исследуемым веществом цитотоксичности и цитостатичности должна быть определена в культурах (или параллельных культурах), в которых анализируют микроядра.
4 Описание метода
Используют первичные культуры лимфоцитов периферической крови человека [6, 20, 43, 44] и ряд клеточных линий грызунов, таких как СНО, V79, CHL/IU и L5178Y [19, 20, 21, 22, 23, 26, 27, 28, 29, 31]. Использование других клеточных линий и типов должно быть научно обосновано по критериям, описанным в разделе «Критерии приемлемости». Так как спонтанная частота микроядер влияет на чувствительность метода, рекомендуется использовать типы клеток с низкой, стабильной спонтанной частотой образования микроядер.
Лимфоциты человека следует отбирать у молодых (возраст приблизительно 18-35 лет), здоровых, некурящих индивидов, которые не имели недавнего контакта с генотоксическими химическими веществами и радиацией. Если клетки более чем одного донора объединяют для использования, число доноров должно быть указано. Частота микроядер возрастает с возрастом индивидов и этот тренд более заметен у женщин, чем у мужчин [45]. Это следует принимать во внимание при отборе доноров для объединения.
Что такое микроядерный тест
Микроядерный тест с успехом используется при проведении клинических исследований. Регистрация структурно-функциональных изменений, при которых в клетках выявляется наличие микроядер, представляет собой высокоинформативный и вместе с тем простой в техническом отношении метод оценки влияния на организм различного рода факторов [7]. Некоторые исследователи рекомендуют применение метода учета клеток с микроядрами для массового скрининга лиц, предрасположенных к нестабильности генома, с целью их последующей диспансеризации [8].
В настоящий момент широко распространен микроядерный тест в эпителиоцитах слизистой оболочки ротовой полости человека в связи с отсутствием необходимости в специальном лабораторном оборудовании, сравнительной простотой, быстротой и дешевизной этого анализа. Следует также отметить, что буккальный эпителий является своеобразным «зеркалом», отражающим состояние всего организма в целом [3]. Поэтому результаты микроядерного теста в клетках данного типа могут служить показателем действия на организм эндо- и экзогенных факторов, вызывающих численные и структурные аберрации хромосом и приводящие к образованию микроядер [19, 20]. Повышенный уровень микроядер в клетках слизистого эпителия полости рта может служить своеобразным сигналом различных патологических состояний организма (аллергозы, паразитарные инвазии, некоторые генетические болезни), косвенно указывая на нарушения в работе иммунной системы организма [18].
Выполнены работы по определению частоты буккальных клеток с микроядрами у пациентов с пигментной ксеродермой [29], у опухолевых больных [10], у больных оральной и фарингиальной карциномой, алкоголиков [28], у детей, страдающих хроническим тонзиллитом [30], и больных гастродуоденитом [15], при различных инфекционных заболеваниях (брюшной тиф, дизентерия и др.) [8], у больных клещевым энцефалитом [9], у больных шизофренией с непрерывным типом течения [12], при пародонтите [12], у больных системной красной волчанкой [26], при аллергических состояниях [1], у часто болеющих (более 4 раз в год) острыми респираторными заболеваниями детей [27]. Однако не изучено влияние патологических состояний, обусловленных сахарным диабетом I типа, на уровень клеток с цитологическими нарушениями у подростков.
Сахарный диабет занимает третье место по распространенности в мире после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний и представляет важнейшую проблему для современной медицины вследствие частой встречаемости, высокой ранней инвалидизации, смертности по причине развития поздних сосудистых осложнений, значительных экономических затрат общества на лечение. Эпидемиологические исследования в разных странах свидетельствуют об увеличении количества случаев возникновения сахарного диабета I типа у детей и подростков. Именно в этом возрасте данная болезнь представляет собой тяжелое страдание, которое меняет весь жизненный уклад семьи, требует пристального внимания, больших физических и эмоциональных усилий, экономических затрат со стороны ребенка и родителей, работников органов здравоохранения и общества в целом [6].
При сахарном диабете I типа в крови больных уменьшается количество общего белка, повышается концентрация креатинина и мочевины, уровень холестерина и триглицеридов превышает нормы [25], отмечается снижение общего состояния здоровья, ролевого физического, социального и эмоционального функционирования [4], что может отразиться на стабильности генома больных.
В связи с вышесказанным целью работы стало установление стабильности генетического аппарата организма подростков, больных сахарным диабетом I типа, с использованием микроядерного теста в буккальном эпителии ротовой полости.
Материал и методы исследования
Было обследовано 24 подростка (9 девушек и 15 юношей) в возрасте 12–14 лет, больных сахарным диабетом I типа, находящихся на стационарном лечении в БУЗ «Воронежская областная детская больница №1».
Лечение проводили инсулином ультракороткого действия НовоРапид в дозах от 5 до 12 ед. При поступлении и выписке у больных определяли концентрацию глюкозы в крови глюкозоксидазным методом на анализаторе «Humаlizer» (Германия).
Сбор материала (при поступлении больных в стационар и выписке), приготовление временных препаратов буккального эпителия слизистой ротовой полости, их анализ осуществляли по разработанной ранее методике [11].
Для анализа микроядер отбирали отдельно лежащие клетки с непрерывным гладким краем ядра. Микроядро идентифицировали как хроматиновое тело округлой или овальной формы с гладким непрерывным краем, размером не более 1/3 ядра, лежащее четко отдельно от него, не преломляющее свет, имеющее интенсивность окрашивания и рисунок хроматина как у основного ядра и находящееся в одной плоскости с ядром [23]. Также проводили анализ других типов аберраций (протрузии типа «язык», «разбитое яйцо», насечки, перинуклеарные вакуоли), согласно рекомендациям Юрченко [24].
Для каждого обследуемого вычисляли частоту встречаемости клеток с микроядрами, перинуклеарными вакуолями, насечками, протрузиями типа «разбитое яйцо» и «язык» как отношение числа клеток с той или иной аберрацией к общему числу проанализированных клеток (в ‰), частоту аберраций всех типов – как отношение суммы клеток с перечисленными нарушениями к общему числу проанализированных клеток (в ‰). Определяли спектр нарушений как отношение числа клеток с той или иной аберрацией к общему числу клеток с нарушениями морфологии ядра (в %).
Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета статистической программы Stadia. Процедура группировки данных и их обработка изложены в работе Кулаичева [17]. Сравнивали частоту встречаемости буккальных эпителиоцитов с аномалиями у больных с использованием непараметрических Х–критерия Ван–дер–Вардена и Вилкоксона, так как распределение частот встречаемости аберрантных клеток не подчиняется нормальному закону. Для выявления влияния пола и лечения на частоту клеточных патологий и концентрацию глюкозы в крови использовали двухфакторный дисперсионный анализ. Силу влияния фактора определяли по Снедекору (в %). Сравнение частот нарушений в спектре проводили с использованием Z-апромаксимации для критерия равенства частот. Корреляционные связи между показателями вычисляли с использованием параметрического коэффициента корреляции (r).
Результаты исследования
и их обсуждение
Установлено влияние пола и лечения на уровень глюкозы в крови обследуемых лиц (сила влияния 8,2 % (Р Примечание: * – различия с показателем у девушек достоверны (P Примечание: * – влияние фактора достоверно (P
Что такое микроядерный тест
Рак называют одной из ведущих причин роста смертности во всем мире. Новые статистические данные 2018 г. указывают на увеличение числа случаев онкологических заболеваний до 18,1 миллиона и количества летальных исходов от рака до 9,6 миллиона [1]. В химиотерапии широко используются алкилирующие агенты, обладающие сильными цитотоксическими и деструктивными свойствами. Общим механизмом действия данных соединений является алкилирование азотистых оснований в положении N-7 гуанина в составе молекулы ДНК [2]. Была показана возможность алкилирующих агентов индуцировать специфические стрессовые реакции, способные приводить к активации некоторых компонентов репарации ДНК и элиминации клеток посредством апоптоза [3]. Действие алкилирующих агентов может индуцировать накопление мутаций не только в опухолевых, но и в нетрансформированных клетках организма, повышая риск возникновения вторичных опухолей.
В контексте исследования генотоксической активности микроядерный тест является одним из наиболее чувствительных и хорошо воспроизводимых методов. Микроядра могут быть обнаружены в делящихся клетках и представляют собой фрагменты хромосом (кластогенные эффекты) или целые хромосомы, отставшие на стадии анафазы в ходе митотического деления (анеугенные эффекты). Микроядерный тест (МЯ тест) позволяет также оценивать пролиферативные и цитотоксические эффекты действия различных агентов [4, 5]. Разработаны методики учета микроядер в клетках разных тканей, органов, организмов, в том числе полиорганный микроядерный тест [6].
МЯ тест активно используется для оценки мутагенного потенциала различных противоопухолевых препаратов. В настоящее время происходят активный поиск специфических модификаторов мутагенеза и разработка новых альтернативных комплексов противораковых препаратов. Особое внимание уделяется фитохимическим веществам – вторичным метаболитам, полученным из растительных организмов. Они характеризуются проявлением многих активностей, в частности антимутагенной, антиоксидантной и антипролиферативной. МЯ тест в данном случае может выступать в качестве чувствительного цитогенетического метода для эффективной оценки снижения деструктивного действия химиотерапевтических агентов.
Цель исследования: обобщить опыт использования МЯ теста для оценки генотоксического потенциала противоопухолевых алкилирующих агентов и возможностей для его модификации с помощью препаратов растительного происхождения.
Для поиска статей были использованы электронные базы данных PubMed, Web of Science и TOXLINE.
Критерии включения. Для анализа были использованы статьи, полный текст которых был опубликован на английском языке за последние 10 лет, в которых оценка возможности ослабления повреждений генома алкиляторами (такими как цисплатин, метилметансульфонат и циклофосфамид) под действием фитохимических веществ проводилась с применением стандартного МЯ теста на клетках лабораторных животных. Критерии исключения. Исключались данные работ, выполненных на клетках крови человека (поскольку таких обзоров опубликовано уже довольно много); результаты нерандомизированных исследований; статьи, которые описывали процесс формирования МЯ при действии других препаратов.
В результате реализации данной стратегии поиска были найдены экспериментальные работы, которые были посвящены исследованию генотоксического потенциала алкиляторов. Они были проведены при использовании различных клеток лабораторных животных с применением МЯ теста при комбинации с другими методиками. Исследование по оценке генотоксических эффектов циклофосфамида было осуществлено на полихроматических и нормохроматических эритроцитах лабораторных животных [7]. МЯ тест при комбинировании с анализом pig-a мутации и CD 59- мутантного фенотипа, выполненный на ретикулоцитах и эритроцитах грызунов, подтвердил повышение частоты аберрантных клеток при действии цисплатина [8]. В одном из экспериментов гепатоциты грызунов были использованы для демонстрации деструктивных свойств метилметансульфоната [9]. Кроме того, было также определено, что оценка генотоксического потенциала химиотерапевтических агентов может осуществляться при использовании таких цитогенетических и молекулярно-биологических методов, как FISH, иммуноокрашивание CREST и реакции RAPD-PCR со случайными праймерами 10. Отмечено наличие достаточного количества работ по описанию протективных характеристик фитохимических веществ при их совместном действии с противоопухолевыми препаратами. Поскольку отсутствие математической однородности отобранных экспериментальных результатов не позволяло корректно выполнить мета-анализ, был выбран формат представления работы в виде систематического обзора.
Один из самых широко известных противоопухолевых алкилирующих препаратов – циклофосфамид (cyclophosphamide, СР). Основные эффекты действия данного вещества связаны с образованием фосфорамида в качестве основного вторичного метаболита. Фосфорамид способствует формированию межцепочечных и внутрицепочечных сшивок в составе ДНК и сшивок ДНК – белок [13]. В настоящее время активно тестируются протективные свойства различных растительных экстрактов. Были описаны эффекты масляного экстракта Carapa guianensis (крабовое дерево) биологически активных субстанций, изолированных из двурядки тонколистной (Diplotaxis tenuifolia), и спиртового экстракта Spondias dulcis 15. МЯ тест на клетках костного мозга лабораторных мышей с использованием различных доз и комбинаций препаратов позволил продемонстрировать статистически значимое снижение частоты клеток с микроядрами при использовании данных фитохимических субстанций (таблица).
Модификация генотоксических свойств алкиляторов с помощью фитохимических агентов