Что такое микроклон растений
Что такое клонирование растений и зачем это нужно?
Услышав слова «клон» и «клонирование», многие вспоминают овечку Долли и опыты в недрах таинственных лабораторий, откуда выходят на свет созданные словно под копирку существа. На самом деле, клоны растений окружают нас повсюду и бояться их нет причин!
Действительно ли клоны устрашающи и неестественны для природы? Таким вопросом порой задаются и клиенты нашей компании, уже привыкшие покупать растения, полученные «из пробирки», то есть методом клонального микроразмножения. Давайте попробуем разобраться в том, что такое клон, клонирование и какое отношение эти термины имеют к нашим садам и огородам.
Клон: история понятия
Впервые термин «клон» предложил использовать известный английский биолог Джон Холдейн (1963 г). Клон (в переводе с греч. – «веточка», «побег» и «отпрыск») – это один или несколько новых организмов, возникших из части или целого органа материнского организма.
Чаще всего человек сталкивается с клонированием в мире растений. Ветка смородины, давшая корни в стакане с водой – один из примеров: куст смородины – материнский организм, а веточка, отделенная от него и пустившая корни – это новый, молодой организм, или клон. То есть, когда вы укореняете черенок хризантемы или листок фиалки, вы занимаетесь самым настоящим клонированием!
Размер части материнского растения значения не имеет, это может быть половина куста пиона или всего одна клетка организма. Чтобы клонировать растение, главное, поместить его часть в условия, в которых она смогла бы вырасти в целый организм. При этом новое растение будет обладать теми же свойствами и признаками, что и материнское.
Растения клонируют сами себя
Пример черенкования смородины может привести к мысли о том, что клонирование – явление не естественное, ведь это человек отделяет веточку и ставит ее в воду, а не само растение. Но давайте посмотрим, насколько клонирование распространено в природе. Многие примеры могут вас удивить своей неожиданностью.
Самый известный «любитель» клонирования – садовая земляника (Fragaria ananassa). Каждый год она образует несколько длинных побегов, называемых столонами (усами). На концах усов развиваются новые кустики – розетки, которые быстро укореняются.
До тех пор пока молодая розетка связана с материнской, она фактически является ее веткой, но это состояние временное. Молодая розетка становится самостоятельным растением на следующий год, когда ус, соединявший ее с материнской розеткой, отмирает. Так вполне естественно происходит клонирование в природе.
Слева на рисунке растение земляники садовой с усами и молодыми розетками-клонами (пример естественного клонирования). Справа – клонирование земляники в искусственных условиях
Может показаться, что клонирование не слишком распространено в природе и является исключением, а не правилом. Однако это всего лишь видимость: среди окружающей нас растительности можно обнаружить множество примеров естественного клонирования.
Сходным способом создания своих копий, которым пользуется земляника, обладают лапчатка гусиная (Potentilla anserina) и лютик ползучий (Ranunculus repens). Эти растения также образуют усы с розетками листьев на концах. Поселяясь на участках, сорняки могут серьезно докучать хозяевам сада из-за такого способа размножения.
На рисунке цветение лапчатки – сорняка с удивительным потенциалом клонирования, хорошо известного всем садоводам
На рисунке растения, которые охотно себя клонируют сами. Слева – тиарелла с длинным побегом-усом, который уже дал корни. Справа – всем известный комнатный хлорофитум с новым молодым растением на длинном цветоносе
Многие растения прибегают к другой, хотя и похожей тактике клонирования. Лесная черника (Vaccinium myrtillus) также является отличным специалистом по собственному клонированию. Все начинается с одного кустика, выросшего из семени. Он образует два типа побегов: вертикальные, несущие листья, и горизонтальные, подземные. Горизонтальные побеги, стелясь в толще лесной подстилки, радиально расходятся в разные стороны, ветвятся и формируют боковые побеги. Так образуются весьма внушительные по площади черничники.
Несколько лет все кусты черники остаются связанными друг с другом породившими их горизонтальными побегами. Со временем в центре расширяющегося «горизонтального куста» самые старые кустики отмирают. Такой черничник начинает напоминать так называемые «ведьмины кольца» – круги, образуемые грибами различных видов при разрастании грибницы.
С этого момента связь между кустиками черничника прерывается, и они становятся самостоятельными растениями. Так черника создает сразу множество своих копий, то есть клонирует себя.
На рисунке молодой кустик черники
Водные растения – рекордсмены клонирования
Представители одного из семейств водных растений – водокрасовые (Hydrohariaceae) – считаются настоящими мастерами клонирования. Это семейство хорошо знакомо аквариумистам и любителям садовых водоемов. Водокрасовые в совершенстве освоили тот же способ размножения-клонирования, который практикует земляника.
Самый известный представитель водокрасовых – стрелолист обыкновенный (Sagittaria sagittifolia), житель умеренных рек и озер. Образуя горизонтальные побеги (усы), он быстро распространяется по дну водоема. Стрелолист формирует не только усы, но и клубни, несущие запас питательных веществ для потомков-клонов.
На рисунке слева – цветущее растение стрелолиста. Справа – ус стрелолиста с молодым растением-клоном (в круге)
Типичный представитель этого семейства – водокрас (Hydroharis) – также образует усы. Именно он покрывает прибрежные отмели мелкими листьями, напоминающими листья крошечных кувшинок. Эта кроха способна за лето затянуть поверхность небольшого пруда, распространяясь при помощи усов, которые случайно переносят на лапках водоплавающие птицы, помогая растению размножаться.
В семействе водокрасовых есть растение, которое благодаря непревзойденной способности к клонированию смогло завоевать целый континент. Это элодея канадская (Elodea canadensis), или как ее еще называют «водяная чума». В начале XIX века это растение, цепляясь за нижние части кораблей, «сбежало» из Северной Америки, пересекло Атлантический океан и попало в пресные водоемы Европы.
При помощи вегетативного размножения (клонирования) оно распространилось по всей Европе и уже является обычным растением в водоемах Сибири. Это яркий пример глобального природного эксперимента по клонированию.
Говоря о клонах и кл
онировании, невозможно обойти вниманием самый впечатляющий рекорд, установленный в царстве растений. Роща тополя осинообразного (Populus tremuloides) – знаменитый клон и единый живой организм.
Анализ генома растений этой рощи показал, что все ее деревья имеют один и тот же генотип и являются вегетативными потомками одного растения. Площадь, занимаемая клоном, составляет 43 га, возраст рощи – 80 000 лет. Этому клону даже присвоено имя – Пандо (в переводе с лат. – «распространяющийся всюду»)
Клонирование в мире животных
Не менее удивительно, что клонирование освоили и животные. Из школьного курса биологии многие помнят маленькое хищное животное – гидру (Hydra). Для нее клонирование вполне естественно: на боковой поверхности тела-стебелька образуется нарост в виде веточки, на конце которого впоследствии прорезается рот и вырастают щупальца. Через несколько дней молодая гидра отделяется от тела родительской и начинает самостоятельную жизнь.
На рисунке гидра обыкновенная с молодой гидрой-почкой – пример природного клонирования в мире животных
Клонирование освоили даже хордовые животные (хорда – предшественник позвоночника), то есть дальние родственники человека.
Таким способом могут размножаться асцидии (Ascidiacea). В возрасте личинки они похожи на маленькую рыбку-головастика. Через некоторое время личинка прикрепляется головной частью к камню и претерпевает изменения, в ходе которых на ее теле формируются новые особи – клоны родительского организма.
Клонирование на службе у садоводства
Можно сказать, что природа в какой-то степени превзошла человека в искусстве клонирования, и это явление вовсе не чуждо естественному ходу вещей. Человек давно взял на вооружение этот способ тиражирования копий интересных для него организмов, и в первую очередь – растений. Способов клонирования или, как его принято называть в отношении растений – вегетативного размножения, немало. Это черенкование, отделение усов (например, у земляники), отводки, прививки, разделение кустов.
В начале XX века наука подарила садоводству новый метод размножения – in vitro (ин витро), или культуру изолированных тканей и органов растений. Суть метода в том, что части органов или отдельные органы (обычно небольшого размера) растений стерилизуют и помещают в изолированные стерильные условия, где проходит их выращивание на искусственной питательной среде. В качестве изолированных условий обычно выступают герметично закрытые пробирки или иные прозрачные сосуды.
На рисунке контейнеры с клонированными растениями, готовые к продаже
Логичным будет вопрос: зачем помещать часть растения в изолированные стерильные условия? Ведь, например, оторванный листик сенполии – это отдельный орган и его можно запросто выращивать в стаканчике с водой.
Дело в том, что в 1920-х годах ученые-биологи подошли вплотную к необходимости ответить на вопрос: какова минимальная часть растения, способного вырасти в целый организм? Пытаясь выращивать отдельные органы и их части, взятые от разных растений, ученые столкнулись с существенным препятствием: чем меньше был изолированный фрагмент растения, тем большей опасности поражения бактериями и грибами он подвергался. Попытки культивировать стерильные фрагменты растений в изолированных условиях показали, что даже очень маленький кусочек растения, если он свободен от спор бактерий и грибов, может долго оставаться живым и даже расти!
Эксперимент позволил добиться регенерации из отдельных клеток целого растения, способного к цветению. Ведь чтобы из маленького кусочка, состоящего всего из нескольких сотен или десятков клеток, вырастить полноценный организм, в котором сотни тысяч клеток, требуется значительный объем питания и энергии.
Питательная среда для клонирования
Искусственная питательная среда – единственный компонент технологии размножения in vitro, привнесенный человеком. Но чуждых природе веществ в этой среде практически нет. В ее состав входят:
сбалансированный комплекс минеральных солей;
сахароза (сахар без примесей);
витамины (В1, В3, B6, В8, С), необходимые для поддержания роста;
гормоны (вещества, регулирующие и направляющие рост в необходимую сторону).
Присутствие в среде гормонов может насторожить любителей экологически чистых продуктов. Но давайте вспомним историю этого метода размножения. Французский ученый Жорж Морель в 1960 г. разработал и предложил технологию массового размножения орхидей в культуре in vitro. А одним из основных компонентов среды, который в то время заменял функцию гормонов, вплоть до 80-х годов был сок кокосовых орехов.
В соке кокоса содержатся те же гормоны, которые сейчас отдельно добавляют в питательную среду, а значит, вещества, которые могут показаться нежелательными «искусственными» компонентами, оказались чуть ли не одними из самых естественных.
Технология, предложенная Ж. Морелем, позволяет быстро и эффективно размножать практически любые растения. Ей дали название – клональное микроразмножение. Большинство рододендронов и орхидей, продающихся сегодня в цветочных магазинах, были произведены при помощи именно этого метода. Особенно замечательно то, что эта удивительная технология позволяет размножать в требуемом количестве растения, которые обычно способны давать отростки всего лишь раз в год.
Еще одна уникальная особенность технологии в том, что размножение растений проводится в изолированных условиях, которые позволяют сохранить клоны свободными от грибковых, бактериальных и вирусных болезней. Отсутствие заболеваний – залог полноценного раскрытия потенциала растения.
Надеемся, что теперь слово клон стало более понятным и не таким пугающим, а клонирование и технология клонального микроразмножения подтолкнет вас к увлечению этими интересными процессами.
Сейчас эта технология стала как никогда близка и доступна: с ее помощью получают высококачественный посадочный материал самых разных культур. Мы, сотрудники компании ООО НПП «МИКРОКЛОН«, благодарим вас за внимание и будем рады познакомить ближе с миром клонального микроразмножения.
Наша статья была размещена на сайте Огород.ру по ссылке.
Микроклональное размножение растений
Микроклональное размножение растений
Микроклональное размножение растений — один из способов вегетативного размножения в условиях «in vitro».
Для семенных растений характерно два способа размножения: семенной и вегетативный. Оба эти способа имеют как преимущества, так и недостатки. К недостаткам семенного размножения следует отнести, в первую очередь, генетическую пестроту получаемого посадочного материалa и длительность ювенильного периода. При вегетативном размножении сохраняется генотип материнского растения и сокращается продолжительность ювенильного периода. Однако для большинства видов (в первую очередь для древесных пород) проблема вегетативного размножения остается до конца не решенной.
Это обусловлено следующими причинами:
— не все породы, даже на ювенильной стадии, могут размножаться вегетативным способом с требуемой эффективностью (дуб, сосна, ель, орехоплодные и др.);
— практически невозможно с помощью черенкования размножать многие виды древесных пород в возрасте старше 10—15 лет;
— не всегда удается получать стандартный посадочный материал (возможность накопления и передачи инфекции);
— трудоемкостью и сложностью операций при размножении взрослых (древесных) растений с помощью прививок;
— неэффективностью разработанных технологий для получения достаточного количества генетически однородного материала в течение года.
Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения — клонального микроразмножения (получение в условиях in vitro (в пробирке), неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру). В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, то есть под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму.
Этот метод, несомненно, имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:
— получение генетически однородного посадочного материала;
— освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры;
— высокий коэффициент размножения (105—106 — для травянистых, цветочных растений, 104—105 — для кустарниковых древесных, 104 — для хвойных);
— сокращение продолжительности селекционного процесса;
— ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития;
— размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;
— возможность проведения работ в течение года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала;
Первые достижения в области клонального микроразмножения были получены в конце 50-х годов XX столетия французским ученым Жоржем Морелем, которому удалось получить первые растения-регенеранты орхидей. Успеху Ж. Мореля в микроразмножении способствовала уже разработанная к тому времени техника культивирования апикальной меристемы растений в условиях in vitro. Как правило, исследователи в качестве первичного экспланта использовали верхушечные меристемы травянистых растений: гвоздики, хризантемы, подсолнечника, гороха, кукурузы, одуванчика, салата и изучали влияние состава питательной среды на процессы регенерации и формирования растений. Ж. Морель в своих работах также использовал верхушку цимбидиума (сем. орхидные) состоящую из конуса нарастания и двух-трех листовых зачатков, из которой при определенных условиях наблюдал образование сферических сфер — протокормов. Сформировавшиеся протокормы можно было делить и затем культивировать самостоятельно на вновь приготовленной питательной среде до образования листовых примордиев и корней. В результате им было обнаружено, что этот процесс бесконечен и можно было получать в большом количестве высококачественный и генетически однородный, безвирусный посадочный материал.
В России работы по клональному микроразмножению были начаты в 60-х годах в лаборатории культуры тканей и морфогенеза Института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН. Под руководством чл.-корр. РАН, академика РАСХН Бутенко Р. Г. были изучены условия микроразмножения картофеля, сахарной свеклы, гвоздики, герберы, фрезии и некоторых других растений и предложены промышленные технологии. Таким образом, первые успехи в клональном микроразмножении связаны с культивированием апикальных меристем травянистых растений на соответствующих питательных средах, обеспечивающих в конечном итоге получение растений-регенерантов.
Однако область применения микроразмножения разнообразна и имеет тенденцию к постоянному расширению. Это в первую очередь относится к размножению in vitro взрослых древесных пород, особенно хвойных, и использование техники in vitro для сохранения редких и исчезающих видов лекарственных растений. В настоящее время в этом направлении наметился положительный сдвиг.
Первые работы по культуре тканей древесных растений были опубликованы в середине 20-х годов XX столетия и связаны с именем французского ученого Готре.
В них сообщалось о способности камбиальных тканей некоторых видов вяза и сосны к каллусогенезу in vitro. В последующих работах 40-х годов было выяснено о способности различных тканей вяза листового к образованию адвентивных почек. Однако дальнейший рост и формирование побегов авторами не были получены. Лишь к середине 60-х годов Матесу удалось получить первые растения-регенеранты осины, которые были доведены до почвенной культуры. Культивирование тканей хвойных город in vitro долгое время использовалось как объект исследования. Это было связано со специфическими трудностями культивирования ювенильных и тем более взрослых тканей, изолированных с растения. Известно, что древесные, и особенно хвойные, характеризуются медленным ростом, трудно укореняются, содержат большое количество вторичных соединений (фенолы, терпены и другие вещества), которые в изолированных тканях окисляются различными фенолазами. В свою очередь, продукты окисления фенолов обычно ингибируют деление и рост клеток что ведет к гибели первичного экспланта или к уменьшению способности тканей древесных пород к регенерации адвентивных почек которая с возрастом растения-донора постепенно исчезает полностью. Однако, несмотря на все трудности, ученые все чаще используют в качестве объектов исследований различные ткани и органы древесных растений В настоящее время насчитывается более 200 видов древесных растений из 40 семейств, которые были размножены in vitro (каштан, дуб, береза, клен, осина, гибриды тополей с осиной, сосна, ель, секвойя и др.), а работы в этом направлении ведутся в научных учреждениях Москвы, Санкт-Петербурга, Воронежа, Уфы, Новосибирска, Архангельска, Киева, Одессы, Ялты и др.
Этапы микроклонального размножения растений
Процесс клонального микроразмножения можно разделить на 4 этапа:
1. Выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры.
2. Собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества меристематических клонов.
3. Укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре (+2оС, +10оС).
4. Выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.
Для культивирования тканей на каждом из четырех этапов требуется применение определенного состава питательной среды.
На первом этапе необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры. В тех случаях, когда трудно получить исходную стерильную культуру экспланта, рекомендуется вводить в состав питательной среды антибиотики (тетрациклин, бензилпенициллин и др.) в концентрации 100—200 мг/л. Это в первую очередь относится к древесным растениям, у которых наблюдается тенденция к накоплению внутренней инфекции.
2 этап — собственно микроразмножение. На этом этапе необходимо добиться получения максимального количества мериклонов, учитывая при этом, что с увеличением субкультивирований увеличивается число растений-регенерантов с ненормальной морфологией и возможно наблюдать образование растений-мутантов.
Как и на первом этапе, используют питательную среду по рецепту Мурасига и Скуга, содержащую различные биологически активные вещества, а также регуляторы роста. Основную роль при подборе оптимальных условий культивирования эксплантов играют соотношение и концентрация внесенных в питательную среду цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используют БАП в концентрациях от 1 до 10 мг/л, а из ауксинов—ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л.
При долгом культивировании растительных тканей на питательных средах с повышенным содержанием цитокининов (5—10 мг/л) происходит постепенное накопление их в тканях выше необходимого физиологического уровня, что приводит к появлению токсического действия и формированию растений с измененной морфологией. Вместе с тем, возможно наблюдать такие нежелательные для клонального микроразмножения эффекты, как подавление пролиферации пазушных меристем, образование витрифицированных (оводненных) побегов и уменьшение способности растений к укоренению. Отрицательное действие цитокининов возможно преодолеть, по данным Н.В. Катаевой и Р.Г. Бутенко, путем использования питательных сред с минимальной концентрацией цитокининов, обеспечивающих стабильный коэффициент микроразмножения, или путем чередования циклов культивирования на средах с низким и высоким уровнем фитогормонов.
3 и 4 этапы — укоренение микропобегов, их последующая адаптация к почвенным условиям и высадка в поле являются наиболее трудоемкими этапами, от которых зависит успех клонального микроразмножения. На третьем этапе, как правило, меняют основной состав среды: уменьшают в два, а иногда и в четыре раза концентрацию минеральных солей по рецепту Мурасига и Скуга или заменяют ее средой Уайта, уменьшают количество сахара до 0,5—1% и полностью исключают цитокинины, оставляя один лишь ауксин. В качестве стимулятора корнеобразования используют β-индолил-3-масляную кислоту (ИМК), ИУК или НУК.
Укоренение микропобегов проводят двумя способами:
1) выдерживание микропобегов в течение нескольких часов (2—24 ч) в стерильном концентрированном растворе ауксина (20—50 мг/л) и последующее их культивирование на агаризованной среде без гормонов или непосредственно в подходящем почвенном субстрате (импульсная обработка);
2) непосредственное культивирование микропобегов в течение 3—4 недель на питательной среде, содержащей ауксин в невысоких концентрациях (1—5 мг/л в зависимости от исследуемого объекта). В последнее время предложен метод укоренения пробирочных растений в условиях гидропоники. Этот метод позволяет значительно упростить этап укоренения и одновременно получать растения, адаптированные к естественным условиям. Для картофеля возможно использовать безсубстратную гидропонику для получения мини-клубней. Затенение нижней части культуральных сосудов плотной черной материей или добавление в питательную среду активированного угля способствует укоренению микропобегов.
Пересадка растений-регенерантов в субстрат является ответственным этапом, завершающим процесс клонального микроразмножения. Наиболее благоприятное время для пересадки пробирочных растений — весна или начало лета.
Растения с двумя-тремя листьями и хорошо развитой корневой системой осторожно вынимают из колб или пробирок пинцетом с длинными концами или специальным крючком. Корни отмывают от остатков агара и высаживают в почвенный субстрат, предварительно простерилизованный при 85—90° С в течение 1—2 ч. Для большинства растений в качестве субстратов используют торф, песок (3:1); торф, дерновую почву, перлит (1:1:1); торф, песок, перлит (1:1:1). Исключение составляют семейство орхидных, для которых готовят субстрат, состоящий из сфагнового мха, смеси торфа, листьев бука или дуба, сосновой коры (1:1:1).
Приготовленным заранее почвенным субстратом заполняют пикировочные ящики или торфяные горшочки, в которых выращивают растения-регенеранты. Горшочки с растениями помещают в теплицы с регулируемым температурным режимом (20—22° С), освещенностью не более 5 тыс. лк и влажностью 65—90%. Для лучшего роста растений создают условия искусственного тумана. В тех случаях, когда нет возможности создать такие условия, горшочки с растениями накрывают стеклянными банками или полиэтиленовыми пакетами, которые постепенно открывают до полной адаптации растений.
Через 20—30 дней после посадки хорошо укоренившиеся растения подкармливают растворами минеральных солей Кнудсона, Мурасига и Скуга, Чеснокова, Кнопа (в зависимости от вида растений) или комплексным минеральным удобрением. По мере роста растений их рассаживают в большие емкости со свежим субстратом. Дальнейшее выращивание акклиматизированных растений соответствует принятой агротехнике выращивания для каждого индивидуального вида растений.
Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным условиям является наиболее дорогостоящей и трудоемкой операцией. Нередко после пересадки растений в почву наблюдается остановка в росте, опадение листьев и гибель растений. Эти явления связаны, в первую очередь, с тем, что у пробирочных растений нарушена деятельность устьичного аппарата, вследствие чего происходит потеря большого количества воды. Во-вторых, у некоторых растений в условиях in vitro не происходит образования корневых волосков, что приводит, в свою очередь, к нарушению поглощения воды и минеральных солей из почвы. Поэтому целесообразно на третьем или четвертом этапах клонального микроразмножения применять искусственную микоризацию растений (для микотрофных), учитывая их положительную роль в снабжении растений минеральными и органическими питательными веществами, водой, биологически активными веществами, а также в защите растений от патогенов.
Индийскими учеными предложен простой метод предотвращения быстрого обезвоживания листьев растений, выращенных in vitro, во время их пересадки в полевые условия. Метод заключается в том, что листья в течение всего акклиматизационного периода следует опрыскивать 50%-ным водным раствором глицерина или смесью парафина, или жира в диэтиловом эфире (1:1). Применение этого метода помогает избежать длинных и затруднительных процессов закаливания пробирочных растений и обеспечивает 100%-ную их приживаемость.
Методы клонального микроразмножения
Существует много методов клонального микроразмножения, а также различных их классификаций. Согласно одной из них, предложенной Мурасиге в 1977 году, процесс можно осуществлять следующими путями:
1. Активация пазушных меристем.
2. Образование адвентивных побегов тканями экспланта.
3. Возникновение адвентивных побегов в каллусе.
4. Индукция соматического эмбриогенеза в клетках экспланта.
5. Соматический эмбриогенез в каллусной ткани.
6. Формирование придаточных эмбриоидов в ткани первичных соматических зародышей (деление первичных эмбриоидов).
Н.В. Катаева и Р.Г. Бутенко (1983) выделяют два принципиально различных типа клонального микроразмножения:
1. Активация уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки стебля).
2. Индукция возникновения почек или эмбриоидов de novo :
а) образование адвентивных побегов непосредственно тканями экспланта;
б) индукция соматического эмбриогенеза;
в) дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани.
Этого можно достичь двумя путями: а) удалением верхушечной меристемы стебля и последующим микрочеренкованием побега in vitro на безгормональной среде; б) добавлением в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов. Как правило, в качестве цитокининов используют 6-бензиламинопурин (БАП) или 6-фурфуриламинопурин (кинетин) и зеатин.
Схема размножения растений методом активации уже существующих меристем (по А. Р. Родину, Е. А. Калашниковой, 1993): 1 – путем удаления верхушечной меристемы: 2 – добавлением цитокининов в среду (б/г – среда без гормонов, Ц – цитокинин, А – ауксин)
Полученные таким образом побеги отделяют от первичного экспланта и вновь самостоятельно культивируют на свежеприготовленной питательной среде, стимулирующей пролиферацию пазушных меристем и возникновение побегов более высоких порядков.
Часто в качестве экспланта используют верхушечные или пазушные почки, которые изолируют из побега и помещают на питательную среду с цитокининами.
Образующиеся пучки побегов делят, при необходимости черенкуют и переносят на свежую питательную среду. После нескольких пассажей, добавляя в питательную среду ауксины, побеги укореняют in vitro, а затем переносят в почву, где создают условия, способствующие адаптации растений.
Адаптация пробирочных роз к почвенным условиям
В настоящее время этот метод широко используется в производстве посадочного материала сельскохозяйственных культур, как технических, так и овощных, а также для размножения культур промышленного цветоводства (например, гвоздики), тропических и субтропических растений, плодовых и ягодных культур, древесных растений.