на чем основан метод проточной цитометрии

ТОМ 4, СТ. 131 (стр. 465-470) //

ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ
АНАЛИЗ ИЗОБРАЖЕНИЯ. ПОЛУЧЕНИЕ И ПРЕДСТАВЛЕНИЕ ДАННЫХ

Е.Е.Зуева *
Санкт-Петербургский Медицинский Университет им. акад. И.П.Павлова, Санкт-Петербург, Российская Федерация

Резюме
Иммунофенотипирование клеток крови и костного мозга человека традиционно осуществляется методом проточной цитометрии и позволяет оценивать экспрессию нескольких маркеров одновременно. Использование многоцветного окрашивания требует корректной оценки получаемого изображения. Рассмотрены варианты коэкспрессии маркеров при проведении трехцветного окрашивания. Показана возможность оценки гетерогенности экспрессии маркеров на клетках одной популяции при анализе изображения в пространстве двумерной гистограммы.

Ключевые слова: иммунофенотипирование, проточная цитометрия, анализ изображения

Учет результатов
Анализ антигенной экспрессии осуществляется на проточном цитометре с использованием программного обеспечения для анализа больших массивов данных. Возбуждение флюоресценции происходит при прохождении клеткой фокального пятна аргонового лазера, охлаждаемого воздухом (мощность 15 mW, испускаемая длина волны 488 нм). Учет флюоресценции осуществляется при 512-547 нм, 572-591 нм и более 610 нм для FITC, PE и PerCP/PE-Cy5 каналов флюоресценции на первом (FL1), втором (FL2) и третьем (FL3) фотоумножителях соответственно. Таким образом, получают данные по прямому (FSC) и боковому (SSC) светорассеянию, а также по флюоресценции клеток, связавших флюорохром-конъюгированные антитела. Компенсация наложения флюоресценции осуществляется средствами программного обеспечения. Позитивность окрашивания с любым антителом оценивается при наложении квадрантов, определенных отрицательным изотипическим контролем.

Представление данных
Данные по прямому и боковому светорассеянию исследуемых клеток отражают на двумерных гистограммах FSC/SSC (прямое forward side scatter (FSC) и угловое side scatter (SSC) светорассеяние). Для сигнала по FSC и SSC обычно используют линейное усиление, сигналы флюоресценции могут быть усилены до четырех (пяти) декадной логарифмической шкалы. Логическое ограничение лимфоцитарного гейта определяется по нижнему и верхнему значению лимфоцитарного пика на одномерной гистограмме и применяется к двумерным гистограммам. Моноцитарный гейт касается лимфоцитарного гейта с превышением значения SSC в полтора раза. Гранулоцитарный гейт касается моноцитарного гейта и распространяется вверх по всей оси SSC. Левая и правая границы моноцитарного и гранулоцитарного кластеров определены по соответствующим пикам на одномерных гистограммах. При использовании одноцветного анализа с различными флюорохромами сигналы фотоумножителей FL1, FL2 и FL3 отражены на одномерных четырехдекадных гистограммах. При использовании многоцветного анализа данные по каналам флюоресценции отражены на двумерных четырех декадных log/log гистограммах (FL1/ FL2, FL2/ FL3 и FL3/ FL1). Квадранты в этих гистограммах (FL1/ FL2 (FITC/PE), FL2/ FL3 (PE/PerCP) и FL3/ FL1 (PerCP/FITC)) определяют две разделительные линии, фиксированные для всех измерений на одной четверти шкалы флюоресценции по абсциссе и ординате. Для анализа малоклеточных популяций могут быть также использованы смешанные линейно-логарифимированные гистограммы SSC/FL(1-3).

Анализ данных
Анализ данных заключается в определении положения кластера клеток в многомерном пространстве проточной цитометрии. При выявлении на двумерной гистограмме Fl2/Fl1 кластера событий, позитивного по обоим маркерам, использование трехцветной метки позволяет получить четыре варианта экспрессии третьего маркера (рис.1.)

При одновременном использовании трех антител возможно получение восьми комбинаций положительных и отрицательных популяций (табл1),

расположение которых в пространстве трех четырехдекадных гистограмм (FL1/Fl2, Fl2/Fl3, Fl3/Fl1) строго определено (рис.2).

Варианты сочетанной экспрессии (бинарный вариант). Варианты сочетанной экспрессии маркеров при трехцветном окрашивании. При совместном использовании трех антител возможно получение восьми комбинаций положительных и отрицательных популяций в пространстве трех двумерных гистограмм. Буквенные обозначения аналогичны табл. 1.

Такое изображение может быть получено при гомогенном характере экспрессии, т.е. в том случае, если все клетки популяции однородно экспрессируют каждый анализируемый маркер.

Анализ коэкспрессии маркеров
Далеко не во всех случаях, популяция, позитивная по экспрессии одного маркера, также однородно экспрессирует другой маркер. Для оценки гетерогенности экспрессии маркеров на клетках одной популяции может быть использована схема изображения возможных вариантов коэкспрессии в пространстве двумерной гистограммы (рис.3).

Фактически на двумерной гистограмме может быть представлено всего несколько вариантов коэкспрессии маркеров.

* Адрес для переписки: Зуева Екатерина Евгеньевна, с.н.с. лаборатории молекулярной диагностики Научно-методического центра по молекулярной медицине СПбГМУ им. акад.И.П.Павлова, ул. Л.Толстого, 6/8, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 197089. Тел/факс: +7 812-2387194, e-mail: dinzu@mail.ru

1 Молекулярная клиническая диагностика. Методы. Под ред. С.Херрингтона и Дж. Магки, М.,Мир, 1999, 506 стр.

2 Horsburg T., S. Martin, A.J.Robson The application of flow cytometry to histocompatibility testing. Transplant Immunology 2000, 8 (1):3-15.

3 Gelman R., Wilkening C. Analyses of quality assessment studies using CD45 for gating lymphocytes for CD3+CD4+%. Cytometry (Comm in Clin Cytometry) 2000; 42:1-4.

4 Gratama JW, Sutherland DR, Keeney M, Papa S. Flow cytometric enumeration and immunophenotyping of hematopoietic stem and progenitor cells. J Biol Regul Homeost Agents 2001;15:14-22.

5 Hrusak O., Porwit-MacDonald A. Antigen expression patterns reflecting enotype of acute leukemias. Leukemia 2002; 16:1233-1258.

6 Cualing HD. Automated analysis in flow cytometry. Cytometry. 2000 Apr 15;42(2):110-3

Источник

На чем основан метод проточной цитометрии

В структуре онкологической заболеваемости женского населения России РМЖ устойчиво занимает первое ранговое место, составляя при этом 20,4 % [5]. Средняя продолжительность жизни больных диссеминированным РМЖ не превышает 24 месяцев. По данным B. Fisher, около 35 % больных РМЖ во время выявления первичной опухоли имеют клинически определяемые метастазы, кроме того, еще 30–35 % больных имеют микрометастазы, которые в дальнейшем клинически манифестируют [7]. В итоге результаты лечения больных РМЖ остаются неудовлетворительными (прирост грубого показателя смертности за последние 10 лет составил 7,56 %) [5].

Диагностика гематогенного распространения эпителиальных опухолей на ранних стадиях – одна из главных проблем онкологии. Морфологически единичные разрозненные опухолевые клетки не определяются – требуется применение высокочувствительных иммунологических методов. К ним в настоящее время относятся иммуноцитологические (иммуноцитохимический, проточная цитометрия) методы и молекулярно-биологические (RT-PCR) методы. Иммунологические методы исследования костного мозга значительно различаются по своей чувствительности и специфичности, технической сложности и стоимости. Для того чтобы контролировать эффективность воздействия лекарственных средств на микрометастазы нужно, в первую очередь, стандартизировать методы количественной оценки единичных диссеминированных опухолевых клеток. Речь идет об иммунологическом стадировании рака [4]. В клинической практике пока не найдено рутинных методов обнаружения микрометастазов. Методы исследования костного мозга нуждаются в дальнейшем развитии. Однако уже накапливаются данные о том, что количественное определение и характеристика диссеминированных опухолевых клеток позволяют получить важную прогностическую информацию и проводить мониторинг эффективности терапии. По мере того как методы исследования станут стандартизированными, с приемлемой чувствительностью и специфичностью, это позволит сделать еще один шаг к индивидуализации антиметастатической терапии [1].

В связи с тем, что диссеминированные опухолевые клетки присутствуют в костном мозге в малых количествах, для увеличения чувствительности иммунологических методов исследования были разработаны методы обогащения популяции клеток-мишеней. Техника обогащения включает большую панель технологий, в основе которых лежат различные свойства диссеминированных опухолевых клеток, отличающие их от нормальных гематопоэтических клеток. Стандартной процедурой считается метод градиентной сепарации Ficoll. Кроме того, большинство современных технологий основано на экспрессии молекулы адгезии эпителиальных клеток (EpCAM). Применение, в частности, метода иммуномагнитного обогащения клеток и проточной цитометрии позволяет оценивать до 50 млн миелокариоцитов у одного больного. Для сравнения ‒ иммуноцитологически на цитоцентрифужных препаратах можно оценить обычно 1–2 млн миелокариоцитов [1].

Ранее нами было проведено исследование, в котором изучался костный мозг у 50 больных РМЖ с помощью цитологического, гистологического и иммуноцитохимического методов. От общего числа больных, включенных в исследование, микрометастазы в костный мозг были обнаружены у 19 (38 %) пациенток. Комбинация различных методов диагностики существенно не повысила вероятность выявления опухолевых клеток в костном мозге. Наиболее информативными в плане определения оккультных метастазов в костный мозг были иммуноцитохимический (63,2 %) и гистологический (57,9 %) методы. Таким образом, чтобы максимально повысить вероятность диагностики метастазов в костный мозг, целесообразно одновременно пользоваться обоими методами. Что становится весьма актуальным для правильного стадирования опухолевого процесса и составления дальнейшего плана лечения [3].

Целью настоящей работы явилось установление степени гематогенной диссеминации РМЖ на основании обнаружения диссеминированных опухолевых клеток высокочувствительным иммуноцитологическим методом с применением моноклональных антител к эпителиальным антигенам.

Материалы и методы исследования

В работе использованы материалы клинического, морфологического, иммуноцитологического обследования 28 больных РМЖ, находящихся на лечении в ГУЗ «Областной клинический онкологический диспансер» с ноября 2011 г. по настоящее время. На проведение данного исследования было получено разрешение этической комиссии ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет». Исследования проводились с соблюдением законодательства РФ, этических норм и принципов Декларации Хельсинки (1964) со всеми последующими дополнениями и изменениями, регламентирующими научные исследования на биоматериалах, полученных от людей, а также международным руководством для биомедицинских исследований с вовлечением человека (International ethical guidelines for biomedical research involving human subjects) Совета международных организаций медицинских наук (CIOMS). Все первичные данные пациенток были обезличены в соответствии с требования п. 3 ст. 6 действующего Федерального закона РФ 152-ФЗ «О персональных данных».

В исследуемую группы вошли женщины в возрасте от 33 до 74 лет. Средний возраст составил 56 ± 11,0 лет. На момент постановки первичного диагноза пациентки распределились по стадиям следующим образом: I стадия была диагностирована у 1 (3,6 %) больной, IIА – у 7 (25 %), IIВ – у 3 (10,7 %), IIIА – у 6 (21,4 %), IIIВ – у 3 (10,7 %), IIIC – у 4 (14,3 %), IV – у 4 (14,3 %). Наиболее частым гистологическим вариантом был инфильтративный смешанный рак (42,9 %). Отмечена достаточно высокая частота инфильтративного протокового рака (28,6 %). Реже встречались инфильтративный дольковый рак (21,4 %) и другие формы рака (медуллярный, папиллярный, тубулярный) – 7,1 %. Больным было проведено стандартное клиническое обследование. Исследование костного мозга до начала лечения выполнялось как стандартными цитологическим и гистологическим методами, так и методом проточной цитометрии с применением МКА к цитокератинам EpCAM (CD326). Материал для цитологического исследования и проточной цитометрии получали с помощью стернальной пункции. Объем костномозгового пунктата не превышал 0,5 мл, т.к. при большем объеме возможно разбавление образца периферической кровью. Проточная цитометрия проводилась на базе лаборатории иммунологии гемопоэза ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» РАМН (руководитель – д.м.н., проф. Н.Н. Тупицын). Исследование проводилось в координатах CD45/CD326. Предварительно было проведено иммуномагнитное обогащение клеток, связывающих антитела CD326 (EpCAM). Это позволило оценивать до 50 млн миелокариоцитов у одного больного. Подсчет клеток миелограммы и их анализ производился в клинической лаборатории. Для гистологического исследования выполнялась трепанбиопсия задне-верхней ости подвздошной кости с двух сторон.

Результаты исследования и их обсуждение

При стандартном цитологическом исследовании метастазы в костный мозг не были выявлены ни у одной из 28 пациенток. У 5 из 28 больных в микропрепаратах были обнаружены «единичные недифференцированные клетки неясного происхождения, возможно, негемопоэтической природы». При проточной цитометрии у 2 из этих 5 пациенток выявлены микрометастазы в костном мозге. При гистологическом исследовании трепанобиоптатов лишь у 1 (3,6 %) пациентки были обнаружены метастазы в костный мозг (рис. 1). Исходная стадия у этой пациентки была расценена как T4N3aM0 (IIIC), после гистологического обнаружения метастазов в костный мозг стадия была изменена на IV. При дополнительной остеосцинтиграфии у этой пациентки были выявлены множественные остеопластические метастазы в кости, не подтвержденные рентгенологически. Метастазы в костный мозг в данном случае были подтверждены методом проточной цитометрии.

Рис. 1. Микрофото метастаза инфильтрирующего рака молочной железы в костном мозге больной Д., 58 лет. Окр. гематоксилином и эозином, ×200

У 3 из 28 больных в трепанобиоптатах были обнаружены единичные клетки, подозрительные на раковые, что не было подтверждено иммуноцитологически. Еще у 7 больных в трепанобиоптатах были обнаружены единичные плазматические клетки или микроочаговое их скопление, что является косвенным признаком поражения костного мозга. При проточной цитометрии у 2 из этих 7 пациенток были обнаружены микрометастазы.

Эпителиальные (опухолевые) клетки в образцах костного мозга были выявлены у 24 (89,3 %) из 28 пациенток с помощью проточной цитометрии с применением моноклональных антител ЕрСАМ (CD326). Важно то, что количество опухолевых клеток, определяемых иммуноцитологически, было очень низким и варьировалось от 1 до 118 клеток в образце, что в 82,2 % случаев составило менее 1 клетки на 1 млн миелокариоцитов. Лишь у 5 (17,8 %) из 28 больных было выявлено ≥ 1 (максимум – 10) эпителиальных клеток на 1 млн миелокариоцитов. У двух пациенток была установлена IV стадия РМЖ (T4N3сM1). У одной имелись метастазы в позвоночнике, грудине, легких, плевре. У другой было выявлено поражение селезенки, внутрибрюшных, забрюшинных лимфатических узлов, яичников. Костный мозг обеих пациенток, как показали миелограммы и трепанобиоптаты, был гипоклеточным (особенно это касалось красного ростка). У двух других пациенток изначально была диагностирована IIA стадия РМЖ. Еще у одной больной изначально была диагностирована IIIB стадия, причем у нее были выявлены метастазы в трепанобиоптате, что потребовало проведения рестадирования – была выставлена IV стадия заболевания (об этом было сказано ранее).

Если считать положительной реакцию при наличии 1 метастатической клетки среди 1 миллиона мононуклеарных клеток (МНК) костного мозга (сумма количества лимфоцитов, моноцитов и плазматических клеток), то число таких пациенток составило 21 (75 %) из 28. При этом только у 3 (10,7 %) из 28 больных число клеток было ≥ 10. У двух больных было выявлено наибольшее число клеток на 1 млн МНК – 32 и 35 соответственно.

Четкий кластер опухолевых клеток при проведении проточной цитометрии был диагностирован у 4 (14,3 %) из 28 пациенток (рис. 2).

При этом число клеток в образцах костного мозга было очень низким: у одной пациентки (IIA стадия) число опухолевых клеток на 1 млн миелокариоцитов равнялось одной, у трех остальных (IIB, IIIA и IIIB стадии) – менее одной клетки. При пересчете на 1 млн МНК это число составило 6, 2, 6 и 4 клетки соответственно.

Полагая, что обнаружение одной изолированной опухолевой клетки может быть диагностически незначимым, ряд исследователей попытался количественно определить «критическую» опухолевую нагрузку, превышение которой достоверно было бы связано с ростом частоты рецидива заболевания. Было показано, что количество рецидивов рака молочной железы резко возрастает при обнаружении в костном мозге 10 или 15 изолированных опухолевых клеток [6]. В нашем исследовании не была прослежена общая и безрецидивная выживаемость в связи с небольшим сроком от начала исследования. Однако одна больная с IV стадией РМЖ, у которой были подтверждены микрометастазы в костный мозг, погибла от прогрессирования заболевания во время проведения ей второго курса химиотерапии.

Рис. 2. Цитограмма больной раком молочной железы Б., 74 лет, IIB стадия, с микрометастазом в костном мозге, выявленным методом проточной цитометрии. Область R1 – это «кластер» из 20 CD45-негативных клеток (ось абсцисс), положительных в реакции с антителами к молекуле адгезии эпителиальных клеток EpCAM (CD326) – ось ординат

В работе Крохиной О.В. и соавт. (ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН) было сделано предположение, что к наиболее ранним проявлениям реакции костного мозга на присутствие отдельных опухолевых клеток можно отнести следующие изменения кроветворения по данным миелограмм: гипоклеточность костного мозга, скопления плазматических клеток, обнаружение крупных клеток с гиперхромным ядром и множественными нуклеолами, повышение лейко-эритробластического отношения, повышенные средние значения количества моноцитов и лимфоцитов [2].

В нашем исследовании в целом у пациенток были обнаружены следующие изменения в миелограммах: снижение клеточности костного мозга (28,6 %), повышение, а также снижение лейко-эритробластического соотношения (25,0 % и 14,3 %, соответственно), повышенные значения количества моноцитов (42,9 %), лимфоцитов (46,4 %) и плазмацитов (10,7 %). У 5 (17,9 %) пациенток из 28 были обнаружены «единичные недифференцированные клетки неясного происхождения, возможно, негемопоэтической природы». У 2 из них были выявлены микрометастазы. Поскольку все эти изменения кроветворения с различной частотой имелись как у пациенток с микрометастазами, так и без них, мы пока не можем утверждать об ассоциации этих признаков с присутствием отдельных опухолевых клеток в костном мозге.

Возможность выявления единичных опухолевых клеток в костном мозге вследствие большей чувствительности является главным преимуществом метода проточной цитометрии в диагностике диссеминированных опухолевых клеток рака молочной железы в костный мозг по сравнению с морфологическими методами исследования: в 5 (17,8 %) и 1 (3,6 %) случаях из 28 соответственно. Следовательно, метод проточной цитометрии позволяет более точно судить о степени гематогенной диссеминации РМЖ в костный мозг, чем стандартные морфологические методы. В то же время обнаружение малого количества опухолевых клеток при проведении проточной цитометрии сложно трактовать в тех случаях, где они не формируют четкого кластера. При наличии такого кластера микрометастазы могут быть констатированы даже при наличии менее 1 опухолевой клетки на 1 миллион миелокариоцитов. Пока остается неясным диагностически значимое пороговое значение количества единичных опухолевых клеток в костном мозге у больных РМЖ. Нет четких данных о том, какова «критическая» опухолевая нагрузка костного мозга, превышение которой было бы связано с ростом частоты рецидива заболевания. На основании анализа миелограмм пока не удалось выявить косвенные признаки присутствия опухолевых клеток рака молочной железы. Работа в данном направлении будет продолжена.

Представленные нами данные демонстрируют необходимость внедрения в клиническую практику иммунологического исследования костного мозга, особенно на ранних стадиях рака молочной железы, для оценки распространенности опухолевого процесса. Методы исследования костного мозга нуждаются в дальнейшем развитии, а оценка значимости обнаружения диссеминированных опухолевых клеток и микрометастазов в костном мозге возможна после анализа результатов общей и безрецидивной выживаемости у данных больных.

Авторы заявляют об отсутствии каких бы то ни было конфликтов интересов с кем бы то ни было в отношении идеи, планирования, выполнения и опубликования результатов настоящего исследования и их последующего использования в коммерческих или иных целях.

Работа поддержана гос. заданием Минобрнауки РФ. Шифр гос. задания 4. 1219. 201.

Рецензенты:

Чарышкин А.Л., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой факультетской хирургии, ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет», г. Ульяновск;

Хайруллин Р.М., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой анатомии человека, ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный университет», г. Ульяновск.

Источник

• ← на чем основан метод перманганатометрии
• на чем основан метод синектики →