Что такое конъюгат в ифа
Иммуноферментный анализ
Иммуноферментный анализ (ИФА) — один из видов иммунохимического анализа. Он основан на высокоспецифической иммунологической реакции антигена (АГ) с соответствующим антителом (АТ) с образованием иммунного комплекса. При этом один из компонентов конъюгирован с ферментом. В результате реакции фермента с хромогенным субстратом образуется окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически.
Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные стадии:
В реакции участвуют:
Твердая фаза
В качестве твердой фазы для проведения ИФА можно применять различные материалы: полистирол, поливинилхлорид, полипропилен и другие. Твердой фазой могут служить стенки пробирки, 96-луночные и др. планшеты, шарики, бусины, а также нитроцеллюлозные и другие мембраны, активно сорбирующие белки.
Антигены и антитела
АГ и AT, используемые в ИФА, должны быть высокоочищенными и высокоактивными. АГ должны обладать высокой антигенностью, оптимальной плотностью расположения и количеством антигенных детерминант.
Чувствительность ИФА зависит от концентрации, активности и специфичности используемых антител. Используемые АТ могут быть поли- или моноклональными, различного класса (IgG или IgM) и подкласса (IgG1, IgG2).
Чувствительность и специфичность метода повышается при использовании моноклональных антител. В этом случае появляется возможность обнаруживать низкие концентрации АГ (AT) в образцах.
Ферментные маркеры: наибольшее применение нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфатаза (ЩФ) и β-D-галактозидаза.
Субстраты
Выбор субстрата, в первую очередь, определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция «фермент-субстрат» высокоспецифична.
Классификация ИФА
В основу классификации методов ИФА положено несколько подходов:
1 — по типу реагентов, присутствующих на первой стадии ИФА:
2 — по принципу определения исследуемого вещества:
3 — по типу результатов:
Конкурентный ИФА
Конкурентный ИФА для определения антител: искомые антитела и меченые ферментом антитела конкурируют друг с другом за антигены, сорбированные на твердой фазе.
Неконкурентный «сэндвич» – вариант ИФА
Основным достоинством метода является высокая чувствительность, превосходящая возможности других схем ИФА.
Качественный анализ часто используют при скрининговых исследованиях и диагностике инфекционных заболеваний. Результат исследования определяется при сравнении его оптической плотности с расчетной величиной критической оптической плотности (ОПкрит., «Cut-off»).
Формулу для расчета «Cut-off» указывают в инструкции к тест-системе. В расчете «Cut-off» могут участвовать как усредненные значения оптических плотностей положительных и отрицательных контролей, так и оптическая плотность специального контрольного образца — контроля уровня среза.
Если оптическая плотность образца выше, чем Cut-off, образец считается положительным на специфические антитела.
Для полуколичественного варианта проведения методики рассчитывают отношение между средней оптической плотностью образца и оптической плотностью Cut-off.
Образцы рассматриваются как:
Сомнительные результаты анализа нельзя однозначно интерпретировать и для уточнения результата необходимо повторить обследование через 1–2 недели.
Методом ИФА определяют:
Компоненты ИФА
Антигены, используемые в ИФА
В ИФА в качестве иммуносорбента используются, как уже говорилось выше, антигены. Одним из важных моментов при создании диагностического теста является определение его антигенной композиции. При этом, в зависимости от цели диагностики состав антигенов может быть различным.
Известно, что для полноценной и эффективной детекции антител при диагностике инфекционного заболевания, необходимо максимально имитировать антигенный состав нативного возбудителя.
Использование смеси, состоящей из нескольких белковых молекул, для сорбции иммунологических планшетов может приводить к определенным проблемам как биотехнологического, так и экономического характера (усложнение и, следовательно, удорожание процесса производства). Белки могут конкурировать за сорбционную поверхность, а также может происходить взаимодействие белков в реакционной смеси, что может приводить к экранированию части эпитопов. Кроме того, белковые молекулы могут требовать различных условий сорбции, обеспечивающих каждому антигену наиболее полную экспрессию всех эпитопов. Современные методы позволяют конструировать искусственные рекомбинантные молекулы, объединяющие различные антигенные эпитопы, локализованные в разных белках инфекционного агента и даже принадлежащие его разным штаммам. Компьютерный анализ позволяют оценивать пространственную структуру нативных вирусных белков и точно воспроизводить ее при дизайне искусственных молекул антигенов.
Применяемые в ИФА антигены делятся на две группы:
Получение рекомбинантных белков
Е.coli можно культивировать как в аэробных (в присутствии кислорода), так и в анаэробных (без кислорода) условиях. Однако для оптимальной продукции рекомбинантных белков Е.coli и другие микроорганизмы обычно выращивают в аэробных условиях. Если целью культивирования бактерий в лаборатории является синтез и выделение определенного белка, то культуры выращивают на сложных жидких питательных средах в колбах. Для обеспечения условий, оптимальных для максимальной продукции белков, конструируют специальные ферментеры и создают системы аэрации.
Как автономно реплицирующиеся генетические элементы плазмиды обладают всеми основными свойствами, которые позволяют использовать их в качестве вектора для переноса клонируемой ДНК. Но довольно часто природные (немодифицированные, несконструированные) плазмиды бывают лишены некоторых обязательных для «высококачественного» вектора свойств. К таким важным свойствам относятся:
Как работает клонирующий вектор pBR322? Если очищенную кольцевую плазмиду pBR322 обработать рестриктазой, расщепляющей ее в единственном сайте, расположенном в одном из генов устойчивости к тому или другому антибиотику, то образуется линейная молекула с липкими концами. Такие молекулы смешивают с донорной ДНК, содержащей нужный ген и предварительно обработанной такой же рестриктазой. Поскольку липкие концы этих двух ДНК взаимно комплементарны, они спариваются с образованием гибридных молекул. Далее смесь обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4 в присутствии АТФ, в результате чего образуется множество разных комбинаций фрагментов, а также нежелательные продукты, в частности объединившиеся между собой фрагменты донорной ДНК и исходные плазмидные ДНК. Чтобы уменьшить количество последних, обрабатывают рестрицированную плазмидную ДНК щелочной фосфатазой, отщепляющей от линеаризованной молекулы 5′-фосфатные группы: ДНК-лигаза не может сшить концы дефосфорилированной линейной плазмидной ДНК. Что касается собственно рекомбинантных молекул ДНК, то хотя в них и имеются два одноцепочечных разрыва, ее фрагменты удерживаются вместе двумя фосфодиэфирными связями, образовавшимися с помощью ДНК-лигазы между дефосфорилированной плазмидной ДНК и рестрицированной донорной ДНК. После репликации в трансформированной клетке одноцепочечные разрывы устраняются системой лигирования клетки-хозяина.
Ферментный коньюгат
Методы получения конъюгатов, т.е. комплексов фермента со специфическим реагентом, разделяют на химические и иммунохимические. Принцип методов третьей группы заключается в последовательном проведении двух этапов. На первом этапе, с одной стороны, фермент, а с другой стороны, специфический реагент химически модифицируются реагентами, имеющими между собой высокое значение константы связывания, например, авидин-биотин или гаптен-антитело. На втором этапе проводят реакцию между модифицированным ферментом, приводящую к образованию конъюгата по типу антиген-антитело.
Существует достаточно большое число ферментов, используемых в ИФА. В ИФА туберкулеза в качестве фермента чаще применяется пероксидаза хрена. А субстратом для этого фермента является тетраметилбензидин (ТМБ).
Моноклональные антитела
Моноклональные антитела синтезируются отдельными клонами гибридных клеток (гибридомами), которые впервые были получены в 1975 г. Келером и Мильштейном в результате соматической гибридизации клеток миеломных опухолей и В-лимфоцитов, продуцирующих антитела после иммунизации животных соответствующим антигеном.
Слившиеся клетки селезенки-миеломы растут в среде ГАТ, поскольку:
Селекция на ГАТ-среде позволяет избавиться от миеломных клеток и играет ключевую роль ввиду очень малого выхода процесса гибридизации (один гибрид на 500 тыс. клеток селезенки).
Для этого обычно проводят скрининг культуральных сред, содержащих секретируемые антитела. Тестирование гибридом должно осуществляться на самых ранних стадиях после слияния и предполагает использование таких высокочувствительных методов, как иммуноферментный анализ. Среду из тех лунок, в которых есть растущие клетки, отбирают и переносят в лунки другой микротитровальной плашки, предварительно покрытые слоем молекул антигена-мишени. Если в культуральной среде находится антитело (первое антитело), распознающее один из эпитопов данного антигена, то оно свяжется с антигеном и останется в лунках после их промывания. Затем в лунки добавляют второе антитело, специфичное к мышиным антителам. Оно будет присоединяться к любому первому антителу, связанному с антигеном. К используемому в иммунном анализе второму антителу предварительно присоединяют фермент, который превращает неокрашенный субстрат в окрашенное соединение. Изменение цвета содержимого одной из лунок говорит о том, что исходная культуральная среда содержала антитело, специфичное к данному антигену. Если же такое антитело в среде отсутствовало, то второму антителу не с чем будет связываться и оно вымоется при втором промывании. Субстрат в таких лунках останется неокрашенным.
Однако выявленные на этой стадии антитела не обязательно являются моноклональными. Это обусловлено тем, что в ячейке, где культивируют клетки, может оказаться две и более гибридом, каждая из которых синтезирует свой тип антител. Поэтому следующим шагом после селекции является клонирование гибридом, целью которого является разделение клеток и наращивание отдельных клонов из одной клетки. Для этого клеточную суспензию разводят культуральной средой и высевают в другие лунки. После культивирования полученных клонов среды вновь тестируют, определяя, какая из клеточных линий (гибридом) продуцирует моноклональные антитела, распознающие антиген-мишень. В том случае, когда получают более одной специфичной гибридомы, проводят дальнейшие исследования, позволяющие определить, направлены ли антитела, вырабатываемые разными клонами, против одной и той же антигенной детерминанты. Каждый клон, продуцирующий моноклональное антитело, можно поддерживать в культуре практически бесконечно. Кроме того, образцы можно заморозить в жидком азоте и использовать их в дальнейшем как источник клеток.
Важнейшим свойством гибридом, унаследованным от миеломных клеток, представляется их способность давать асцитные опухоли при введении мышам и синтезировать при этом до 15мг антител из 1 мл асцитной жидкости.
Первой стадией при создании гибридных моноклональных антител является получение обычной гибридомы, синтезирующей моноклональные антитела желаемой специфичности к одному из двух антигенов. Затем гибридому адаптируют к росту в присутствии 8-азогуанина и отбирают те клетки, которые способны размножаться на ГАТ-среде. Эти первичные гибридомы, выступающие в роли миеломного партнера, подвергают слиянию с иммунными лимфоцитами мышей, иммунизированных вторым антигеном. В результате слияния и отбора получают дочерние (вторичные) гибридомы, способные синтезировать антитела двойной специфичности. Таким способом были получены гибридные моноклональные антитела, которые одновременно связывались с пероксидазой хрена и поверхностным антигеном. Гибридные антитела оказались стабильными в процессе хранения, не изменяли своей двойственной специфичности и обладали достаточно высокими константами связывания по отношению к обоим антигенам.
Анализ на коронавирус методом ИФА
Анализ на иммуноглобулины класса G к спайковому (S) белку SARS CoV-2 позволяет определить уровень иммунной защиты к вирусу. Такое исследование целесообразно выполнять после вакцинации.
В связи с распространением коронавирусной инфекции COVID-19, отдельное внимание уделяется не только лечению, но и своевременному выявлению. Большинство медицинских учреждений начали тестирование с применения метода ПЦР (полимеразная цепная реакция). Он направлен на выявление вирусной РНК в эпителии верхних дыхательных путей. То есть, если человек уже переболел коронавирусной инфекцией, то результат ПЦР окажется отрицательным.
Далее диагностика COVID-19 стала проводиться с применением иммуноферментного анализа (ИФА). В отличие от ПЦР, ИФА позволяет выявить специфические антитела в крови. Отсюда вытекает одно важное преимущество метода. С его помощью можно выявить не только активные формы болезни, но и определить, переболел человек коронавирусом или нет.
Что такое иммуноглобулины и как они связаны с COVID-19
Иммуноглобулины (Ig) — это специфические белки, которые выделяются клетками иммунной системы в ответ на присутствие патогенов. Основными функциями иммуноглобулинов являются:
Выделяют несколько классов иммуноглобулинов, но если говорить о коронавирусной инфекции (и других заболеваниях), то наиболее интересными являются два из них — IgG и IgM.
Иммуноглобулины класса М первыми вырабатываются в ответ на проникновение в организм того или иного возбудителя. Поэтому определение данных антител играет важное значение в диагностике острой стадии заболевания, когда патоген присутствует в организме.
Иммуноглобулины класса G обеспечивают дальнейшую защиту от повторного проникновения возбудителя. Их максимальная концентрация отмечается примерно через три недели после заражения COVID-19.
Таким образом, IgM говорят о наличии острой инфекции, а IgG помогают подтвердить тот факт, что человек уже переболел.
Каждый желающий может протестироваться на COVID-19 в «ПрофМедЛаб». Вы можете вызвать нашего специалиста для проведения анализа на дом, а также заключить с клиникой договор на проведение тестирования у сотрудников от имени юридического лица.
В «ПрофМедЛаб» выполнено уже более 30000 анализов на коронавирусную инфекцию.
Особенности иммуноферментного анализа
Метод ИФА отличается простотой, высокой скоростью анализа (особенно актуально для экспресс-тестов) и позволяет получить дополнительную информацию (человек переболел или еще болеет). Кроме того, исследование может быть качественным и количественным. В первом случае определяет сам факт присутствия специфических иммуноглобулинов, а во втором определяется их концентрация, что позволяет косвенно судить о течении заболевания.
Вместе с тем у метода есть и определенные недостатки. Одним из них является относительно низкая чувствительность и специфичность. То есть ИФА может давать ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Кроме того, иммуноферментный анализ будет неинформативным, если его проводить в первые несколько дней после заражения, так как уровень иммуноглобулинов повышается в течение 3–5 дней. Наконец, ИФА позволяет определить реакцию иммунной системы на присутствие в организме конкретного возбудителя, однако сам патоген выявить данным методом не получится.
Именно поэтому в некоторых случаях целесообразно сочетать ИФА и ПЦР для получения достоверных и максимально полных данных об особенностях течения коронавирусной инфекции.
Стоимость исследования
Клиника «ПрофМедЛаб» предлагает несколько видов тестов на антитела к COVID-19:
Срок готовности исследования — от 1 дня с момента забора материала. Цены на эти и другие виды анализов представлены в таблице:
Как заказать анализ?
Для сдачи анализа, пожалуйста, заполните форму ниже.
Для получения информации звоните по телефону: +7 (495) 120-08-07.
ИФА-Хлами-IgG-Tr
ИФА-Хлами-IgG-Tr
ИФА-Хлами-IgG-Tr
Назначение набора
Набор предназначен для выявления видоспецифических антител класса G к Chlamydia trachomatis в сыворотке или плазме крови человека “in vitro” методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа.
2.1 Состав набора:
Положительный контрольный образец (К + )
Отрицательный контрольный образец (К – )
Конъюгат (Кг)
Раствор для разведения сывороток (РР-С)
Раствор для разведения конъюгата (РР-К)
Буферный раствор для субстрата (БРС)
25-кратный концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином (ФСБ-Т×25)
Комплект ванночек для реагентов с наконечниками для многоканальных пипеток
2.2 Основные компоненты набора «ИФА-Хлами-IgG-Tr» – иммуносорбент и конъюгат (раствор конъюгата).
Иммуносорбент представляет собой разборный полистироловый планшет, в лунках которого сорбирован рекомбинантный антиген (С-концевой фрагмент основного белка наружной мембраны МОМР) Chlamydia trachomatis.
Конъюгат (раствор конъюгата) представляет собой моноклональные антитела мыши к IgG человека, конъюгированные с пероксидазой хрена.
Положительный контрольный образец – сыворотка крови человека, содержащая видоспецифические антитела класса G к Chlamydia trachomatis и не содержащая антитела к ВИЧ-1, ВИЧ-2, вирусу гепатита С и Treponema pallidum и HВs-антиген, инактивированная прогреванием при температуре 56 °С в течение 3 ч.
Отрицательный контрольный образец – сыворотка крови человека, не содержащая антитела к Chlamydia trachomatis, ВИЧ-1, ВИЧ-2, вирусу гепатита С, Treponema pallidum и HВs-антиген, инактивированная прогреванием при температуре 56 °С в течение 3 ч.
Принцип работы набора. При внесении в лунки планшета образцов сыворотки (плазмы) инфицированной крови человека видоспецифические антитела к Chlamydia trachomatis связываются с антигеном Chlamydia trachomatis, сорбированном на поверхности лунок планшета иммуносорбента, образуя иммунные комплексы «антиген–антитело». Образовавшиеся комплексы выявляют при помощи иммуноферментного конъюгата. После отмывания несвязавшихся компонентов комплекс «антиген–антитело класса G–конъюгат» выявляют, добавляя в лунки планшета раствор субстрата пероксидазы (перекись водорода) и хромогена (ТМБ). При этом в лунках, содержащих видоспецифические антитела к Chlamydia trachomatis, происходит изменение окраски раствора. В лунках, не содержащих видоспецифические антитела к Chlamydia trachomatis, изменение окраски раствора не произойдет.
Пероксидазную реакцию останавливают, добавляя стоп-реагент (0,9 М раствор серной кислоты). Интенсивность окрашивания раствора в лунках измеряют на спектрофотометре как величину оптической плотности (ОП), ОЕ, при длине волны 450 нм.
Величина ОП прямо пропорциональна концентрации видоспецифических антител, содержащихся в образце сыворотки (плазмы) крови человека. Чем выше содержание видоспецифических антител класса G к Chlamydia trachomatis в образце, тем выше интенсивность окрашивания раствора.
2.3 Набор рассчитан на проведение 12 постановок ИФА: 1 постановка – 1 стрип (8 лунок). Всего – 96 определений, включая контрольные образцы.
Продолжительность анализа составляет 1 ч 15 мин.
3.1 Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными. Однако работа со всеми исследуемыми образцами сыворотки (плазмы) крови человека, которые следует рассматривать как потенциально инфицированные, способные сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита В или любой другой возбудитель вирусной инфекции, с отработанными растворами и жидкостями, различным оборудованием, которое может быть загрязнено в процессе анализа, требует определенных мер безопасности при использовании набора:
— работу необходимо проводить в специально оборудованном помещении;
— работать необходимо с применением средств индивидуальной защиты и с соблюдением мер предосторожности в соответствии с требованиями [1], [2], и [3].
3.2 Стоп-реагент, содержащий серную кислоту, обладает раздражающим действием. При попадании на кожу и слизистые немедленно промыть большим количеством воды.
3.3 При работе с набором рабочие места должны быть обеспечены приточно-вытяжной вентиляцией.
3.4 Все лица, работающие в лаборатории с наборами, должны проходить обязательный медицинский осмотр в соответствии с требованиями [4].
3.5 Утилизация медицинских отходов и/или неиспользованных наборов с истекшим сроком годности должна производиться в соответствии с требованиями [5].
4.1 Для исключения ложных результатов исследуемые образцы сыворотки (плазмы) крови человека необходимо готовить и хранить в условиях, предотвращающих бактериальный пророст. Необходимо осветлять образцы сыворотки крови человека, содержащие агрегированные компоненты сыворотки или осадок, при помощи центрифугирования в течение 15 мин при скорости вращения 3000 об/мин. Образцы сыворотки крови человека можно хранить при температуре (2-8) °С не более 7 суток. Замороженные образцы (желательно до температуры минус 20 °С и ниже) можно хранить не более 12 месяцев. Допускается замораживание образца не более двух раз, поэтому следует избегать повторных циклов замораживания-оттаивания образцов за счет оперативности проведения анализа.
Необходимо помнить, что образцы с гемолизом, гиперлипидемией, бактериальным проростом, а также длительно хранившиеся без замораживания не пригодны для анализа.
Надежность результатов зависит от выполнения следующих правил:
— не допускается использование набора после окончания срока годности, а также смешивание компонентов наборов разных серий;
— для приготовления каждого реагента должна использоваться отдельная емкость;
— всю используемую для приготовления реагентов посуду нельзя обрабатывать дезрастворами и моющими средствами. В случае необходимости промыть водой питьевой проточной, а затем пять раз ополоснуть дистиллированной водой;
— для работы с РХ и хромогеном ТМБ необходимо использовать отдельные емкости для растворов и наконечники для пипеток;
— необходимо обратить внимание на тщательное перемешивание реагентов;
— время между заполнением и опорожнением лунок планшета растворами и реагентами должно быть не менее 30 с. Не допускается подсыхание лунок на всех этапах постановки ИФА;
— при использовании промывателя необходимо следить за состоянием емкости для раствора для промывания планшета и соединительных шлангов: в них не должно быть признаков бактериального или грибкового роста;
— необходимо использовать пипетки автоматические со сменными наконечниками, аттестованные по значению средней дозы и сходимости результатов пипетирования (погрешность не более 3 %);
— дозаторы и рабочие поверхности обрабатывать раствором с объемной долей спирта этилового 70 %. Не использовать хлорамин и другие хлорсодержащие вещества;
— для работы с образцами исследуемой сыворотки (плазмы) крови человека и контрольными образцами рекомендуется использовать одноразовые наконечники для пипеток. Каждый образец сыворотки (плазмы) крови человека, а также реагенты набора необходимо отбирать отдельным наконечником;
— при внесении в лунки раствора Кг в рабочем разведении (РК) нельзя касаться наконечником пипетки поверхности планшета;
— во время проведения анализа следует избегать попадания прямых солнечных лучей на рабочую поверхность.
5.1 Спектрофотометр вертикального сканирования, позволяющий проводить измерения оптической плотности растворов в лунках планшета при длине волны 450 нм;
— полу- или автоматическое устройство для промывания планшетов (вошер);
— суховоздушный термостат типа ТС-80 М2, поддерживающий температуру (37±1) °С, или аналогичный ему по характеристикам;
— пипетки одноканальные автоматические со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости от 0,01 до 5,0 мл;
— пипетки 8-ми канальные автоматические со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости до 0,5 мл;
— мерный цилиндр вместимостью 1000 мл;
— флаконы стеклянные вместимостью 20 мл;
— ванночки для реагентов или чашки Петри (диаметр 100 мм);
— вата медицинская гигроскопическая;
— перчатки резиновые хирургические;
— раствор с объемной долей этилового спирта 70 %;
— раствор с массовой долей перекиси водорода 6 %;
— вода деионизированная или дистиллированная;
— контейнер для сбора твердых отходов;
— контейнер для слива жидких отходов.
6.1 Набор реагентов перед проведением анализа извлечь из холодильника, открыть крышку коробки и выдержать компоненты набора при температуре (18-25) °С в течение 30 мин.
Все образцы сыворотки (плазмы) крови человека и реагенты набора перед проведением анализа необходимо тщательно перемешать.
Расход реагентов набора для постановки анализа, который определяется количеством используемых стрипов, приведен в таблице А.1 Приложения А.
6.2 Приготовление раствора для промывания планшета
6.3 Подготовка иммуносорбента
Иммуносорбент готов к использованию.
Открыть пакет и установить на рамку необходимое количество стрипов. Неиспользованные стрипы хранить в плотно закрытом пакете с влагопоглотителем при температуре (2-8) °С не более 3 месяцев.
Внимание! Во флаконах с РР-С, РР-К возможно выпадение осадка. Перед использованием содержимое флаконов тщательно перемешать, не допуская образования пены.
Неиспользованные РР-С, РР-К, БРС и стоп-реагент после вскрытия флаконов можно хранить в закрытых флаконах при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.
6.5 Приготовление раствора Кг в рабочем разведении
Из флакона с Кг отобрать указанный в таблице А.1 Приложения А объем и перенести во флакон с РР-К. Содержимое флакона тщательно перемешать, не допуская образования пены.
В случае использования одного или несколько стрипов в чистый флакон отобрать необходимое количество РР-К, добавить Кг в соответствии с таблицей А.1 Приложения А и перемешать раствор, не допуская образования пены.
Внимание! Раствор Кг в рабочем разведении готовить непосредственно перед использованием! Раствор Кг в рабочем разведении можно хранить не более 15 мин при температуре (18-25) °С. Необходимо использовать только новую ванночку для реагентов и новые наконечники!
Остаток Кг можно хранить в закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.
6.6 Приготовление рабочего раствора субстрата
Если флакон с хромогеном ТМБ содержит кристаллы, его необходимо прогреть перед использованием в течение (3-5) мин при температуре (37±1) °С до полного растворения кристаллов.
Из флакона с хромогеном ТМБ отобрать указанный в таблице А.1 Приложения А объем и перенести во флакон с БРС. Содержимое флакона осторожно перемешать.
В случае использования одного или несколько стрипов в чистый флакон отобрать необходимое количество БРС, добавить хромоген ТМБ в соответствии с таблицей А.1 Приложения А и осторожно перемешать раствор.
Внимание! Рабочий раствор субстрата готовить непосредственно перед использованием в защищенном от света месте! Раствор можно хранить не более 20 мин при температуре (18-25) °С в защищенном от света месте.
Раствор необходимо предохранять от попадания света и контакта с металлами или ионами металлов. Перед использованием раствор субстрата должен быть бесцветным. Посуду, которая будет в ходе реакции контактировать с раствором субстрата, отмывать без применения синтетических моющих средств. Необходимо использовать только новую ванночку для реагентов и новые наконечники.
Остаток хромогена ТМБ можно хранить в закрытом флаконе при температуре (2-8) °С в течение срока годности набора.
7.1 Для промывания планшета рекомендуется использовать автоматический или полуавтоматический промыватель – вошер; в случае отсутствия вошера можно промывать лунки 8-канальной пипеткой;
— на всех этапах промывания необходимо контролировать заполнение всех лунок и полное удаление (аспирацию) жидкости из них;
— необходимо при каждом промывании все лунки заполнить раствором до краев (0,30-0,35 мл в лунку), без переполнения и перетекания жидкости из соседних лунок;
— необходимо выдерживать лунки, заполненными раствором для промывания планшета, в течение 30 с;
— при каждой аспирации тщательно удалять остатки жидкости из лунок постукиванием рамкой со стрипами в перевернутом положении по сложенной в несколько раз фильтровальной бумаге, положенной на лист полиэтилена;
— некачественное промывание планшета приводит к получению некорректных результатов.
8.1 Промыть лунки иммуносорбента раствором для промывания планшета (п 6.2) один раз. Для этого необходимо внести во все лунки по (0,30-0,35) мл раствора, а затем удалить содержимое лунок иммуносорбента в емкость с дезраствором. По окончании промывания тщательно удалить остатки жидкости из лунок, постукивая планшетом иммуносорбента в перевернутом положении (лунками вниз) по сложенной в несколько раз фильтровальной бумаге, положенной на лист полиэтилена.
8.2 В лунки иммуносорбента внести контрольные образцы. Схема внесения контрольных образцов в лунки иммуносорбента при постановке анализа:
8.3 В остальные лунки иммуносорбента внести по 0,06 мл (60 мкл) РР-С, затем внести по 0,04 мл (40 мкл) образцов исследуемой сыворотки (плазмы) крови человека. Раствор в каждой лунке перемешать пять раз пипетированием, при этом во время пипетирования цвет РР-С должен измениться!
Внимание! Общее время внесения в лунки иммуносорбента контрольных и исследуемых образцов не должно превышать (5-10) мин! Каждый образец необходимо отбирать одноразовым наконечником!
8.4 Планшет иммуносорбента заклеить пленкой или закрыть крышкой и инкубировать в термостате при температуре (37±1) °С в течение 30 мин.
8.5 Удалить содержимое лунок иммуносорбента с помощью промывателя, затем промыть лунки иммуносорбента раствором для промывания планшета (п 6.2) пять раз.
Внимание! Раствор Кг в рабочем разведении необходимо вносить в лунки иммуносорбента с использованием одноразовых наконечников, прилагаемых к набору!
8.7 Планшет иммуносорбента заклеить пленкой или закрыть крышкой и инкубировать в термостате при температуре (37±1) °С в течение 30 мин.
8.8 Удалить содержимое лунок иммуносорбента с помощью промывателя, затем промыть лунки иммуносорбента раствором для промывания планшета (п 6.2) пять раз.
Внимание! Рабочий раствор субстрата необходимо вносить в лунки иммуносорбента с использованием одноразовых наконечников, прилагаемых к набору!
8.10 Планшет иммуносорбента заклеить пленкой или закрыть крышкой и инкубировать при температуре (37±1) °С в защищенном от света месте в течение 15 мин.
Внимание! По окончании инкубации в лунках иммуносорбента с образцами сывороток, содержащими видоспецифические антитела класса G к Chlamydia trachomatis, произойдет изменение окраски раствора различной интенсивности в зависимости от концентрации антител: от бесцветной до голубой.
8.11 Остановить пероксидазную реакцию путем внесения во все лунки иммуносорбента по 0,05 мл (50 мкл) стоп-реагента.
Внимание! В лунках иммуносорбента с образцами сывороток, содержащими видоспецифические антитела класса G к Chlamydia trachomatis, произойдет изменение окраски раствора различной интенсивности в зависимости от концентрации антител с голубой (синей) на желтую.
8.12 Не позже чем через (1-2) мин после остановки реакции определить значения ОП, ОЕ, в лунках иммуносорбента в одноволновом режиме при длине волны 450 нм.