Что такое индефицированный вирус
Идентификация вирусов
Смотреть что такое «Идентификация вирусов» в других словарях:
Идентификация микробов — определение систематического положения выделенной из какого либо источника к ры до уровня вида или варианта. И. м. необходима для постановки микробиол. д за, установления контаминации объектов внешней среды и для др. целей. Первое условие… … Словарь микробиологии
Аграновский, Алексей Анатольевич — В Википедии есть статьи о других людях с такой фамилией, см. Аграновский. Доктор Аграновский … Википедия
Вирусологические исследования — имеют целью обнаружение вирусов, их отождествление (идентификацию) и изучение биологических свойств. Для выделения вирусов (См. Вирусы) от человека, животных и растений исследуемый материал вводят в организм чувствительных к вирусам… … Большая советская энциклопедия
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ — детальное изучение живых клеток и их составных частей (органелл), прослеживающее роль отдельных идентифицируемых соединений в функционировании этих структур. К сфере молекулярной биологии относится исследование всех связанных с жизнью процессов,… … Энциклопедия Кольера
Медицина — I Медицина Медицина система научных знаний и практической деятельности, целями которой являются укрепление и сохранение здоровья, продление жизни людей, предупреждение и лечение болезней человека. Для выполнения этих задач М. изучает строение и… … Медицинская энциклопедия
Вирусологи́ческие ме́тоды иссле́дования — методы изучения биологии вирусов и их идентификации. В вирусологии широко используются методы молекулярной биологии, с помощью которых удалось установить молекулярную структуру вирусных частиц, способы проникновения их в клетку и особенности… … Медицинская энциклопедия
Список паразитов человека — Паразиты человека это паразиты, заражению которыми подвержен человек. Общее определение слова «паразит» касается не только многоклеточных и простейших, живущих за счёт своего хозяина и во вред последнему, но также вирусов, бактерий и грибов … Википедия
Сме́шанные инфе́кции — (позднелат. intectio заражаю синоним ассоциированные инфекции, микстинфекции, сочетанные инфекции) инфекционные процессы, развивающиеся в организме при одновременном сочетанном воздействии двух и более возбудителей. Определяющее значение в… … Медицинская энциклопедия
Deep packet inspection — (DPI) технология накопления статистических данных, проверки и фильтрации сетевых пакетов по их содержимому. В отличие от брандмауэров, Deep Packet Inspection анализирует не только заголовки пакетов, но и полное содержимое трафика на уровнях … Википедия
Менингит — Чистая культура Neisseria meningitidis. Окраска п … Википедия
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ (позднелат. identificare отождествлять; вирусы) — определение родовой и видовой принадлежности вирусов, установление их тождественности или отличия при сопоставлении с уже известными вирусами.
И. в. является заключительным этапом при лабораторной диагностике вирусных заболеваний; широко проводится также при эпидемиол, исследованиях и при работе в области теоретической вирусологии.
И. в. осуществляется путем изучения их морфологии, физ.-хим. свойств, биол, особенностей и антигенной структуры; ее проводят на основе существующей классификации вирусов. При И. в. сначала определяют их принадлежность к определенной классификационной группе. Если группа представляет собой семейство, дополнительно определяют род вируса (напр., принадлежность изучаемого пикорнавируса к энтеро- или риновирусам). Далее устанавливают вид вируса, а для видов, подразделяющихся на типы (напр., вирусы полиомиелита, гриппа), также их тип.
Групповая принадлежность вируса обусловливается видом входящей в его состав нуклеиновой к-ты и ее мол. весом, местом формирования (сборки) капсида в клетке, числом капсомеров, видом симметрии нуклеокапсида, наличием или отсутствием оболочки, липидов, размерами вириона. Практически для И. в. обычно достаточно определения лишь нескольких, наиболее важных из перечисленных показателей.
После установления рода определяют вид вируса (а для определенных вирусов также тип) путем изучения его антигенной структуры с помощью иммунных сывороток к типичным представителям различных видов (и типов) вирусов данного рода. Реже с той же целью используют другие методы.
Наиболее сложной является И. в., которые по своим характеристикам не могут быть отнесены ни к одной из существующих классификационных групп. Очень ответственным является заключение, что изучаемый вирус отличен от всех известных; оно может быть сделано лишь после изучения всего комплекса его свойств.
И. в., как правило, проводится после их размножения в лаборатории, поэтому для исследования берутся органы зараженных животных, ткани и жидкости эмбрионов птиц, питательная среда или клетки инфицированных клеточных и тканевых культур. Если вирус не удается культивировать в лабораторных условиях, то для И. в. используют материал, взятый непосредственно от больного или погибшего организма.
Размеры вируса наиболее точно определяют при помощи электронной микроскопии (см.), к-рая одновременно дает возможность получить сведения о структуре вириона. Для электронномикроскопического исследования необходимо иметь высокоочищенный и конц. материал. Для этой цели предпочтительно использовать скоростное центрифугирование в градиенте плотности сахарозы (см. Ультрацентрифугирование), что позволяет не только очистить вирус от балластных веществ, но при наличии в материале нескольких вирусов и разделить их, если они отличаются по величине.
При некоторых вирусных инфекциях с целью быстрой диагностики электронноскопически исследуют материал, взятый без предварительной обработки непосредственно от больного (напр., содержимое пустул для дифференциации оспы и ветрянки). Метод этот находит все более широкое применение при диагностике вирусных инфекций.
Определение размеров вирусов с помощью фильтрации через целлюлозные мембранные фильтры (см. Ультрафильтрация, в вирусологии) является менее точным. Необходимо иметь набор фильтров с различным диаметром пор. Далее для каждого фильтра должен быть определен поправочный коэффициент адсорбции, показывающий соотношение между диаметром пор и максимальным размером вирионов, которые могут через них проходить. С этой целью фильтр калибруют, используя частицы известной величины. Исследуемый материал должен быть освобожден от грубых частиц путем пропускания через стерилизующий фильтр или центрифугирования в течение 10—15 мин. при скорости 2000— 3000 об/мин. Для уменьшения адсорбции вируса предварительно фильтруют какое-либо капиллярноактивное вещество (бульон, р-р пептона и т. п.) или его прибавляют к вирусной взвеси. Фильтрацию материала выполняют последовательно, начиная с наиболее крупнопористого фильтра. Размер вируса получают путем умножения величины пор мембраны, частично его задерживающей, на коэффициент адсорбции для фильтра данной пористости.
Для определения типа входящей в состав вируса нуклеиновой к-ты ее выделяют путем обработки вирусной взвеси водонасыщенным фенолом, анионными детергентами, напр, додецилсульфатом натрия и другими, с последующим хим. анализом. Если вирус размножается в культурах клеток, тип нуклеиновой к-ты часто определяют косвенным методом, который основан на способности галоидопроизводных дезоксиуридина, в частности 5-бром-2-дезоксиуридина, избирательно подавлять размножение ДНК-содержащих вирусов и не влиять на репродукцию большинства РНК-содержащих. Препарат вносят в питательную среду в дозе от 40 до 100 мкг/мл при заражении клеточной культуры вирусом.
Ориентировочные данные о типе нуклеиновой к-ты вирусов можно получить по окраске инфицированных клеток флюорохромами, напр, акридином оранжевым (его используют в разведении 1:10000 — 1:20000 в изотоническом р-ре хлорида натрия с фосфатным буфером pH 7,2—7,4). При соединении с РНК акридин оранжевый флюоресцирует красным, а после реакции с ДНК — зеленым. Этот метод позволяет определить тип нуклеиновой к-ты вирусных компонентов в местах их скоплений внутри клеток. На нем основан метод дифференциальной диагностики ряда респираторных инфекций: делают мазок-отпечаток с нижней носовой раковины больного; после окраски акридином оранжевым внутриклеточные включения вирусов гриппа и парагриппа начинают светиться красным, а при аденовирусной инфекции и герпесе — зеленым.
Наличие или отсутствие в оболочке вирусов липидов устанавливают по чувствительности к действию растворителей липидов, напр, эфира. Вирусную взвесь соединяют с равным объемом эфира, встряхивают в течение 20 мин. при комнатной температуре, затем выдерживают 18—20 час. при t° 4° в плотно закрытой посуде. Далее пробу наливают в чашку Петри и выдерживают для испарения эфира 30 мин. при t° 36—37°, после чего ее титруют параллельно с необработанным материалом для определения количества вируса. При наличии в оболочке вируса липидов он при воздействии эфира инактивируется.
Проведение этих исследований обычно позволяет отнести изучаемый штамм к определенной классификационной группе или к числу неклассифицированных вирусов. Дальнейшую И. в. проводят внутри группы путем их сопоставления с типичными представителями отдельных видов. В ряде случаев исследования внутри группы могут быть ограничены. Так, вирусы семейства пикорна испытывают на устойчивость в кислой среде. Риновирусы при pH 3,0—5,3 в течение 1 — 3 час. инактивируются, в то время как энтеровирусы сохраняют свою инфекционность.
И. в. с помощью серол, реакций проводят путем их испытания с сыворотками к известным вирусам или, наоборот, приготовленные к изучаемым штаммам иммунные сыворотки испытывают с известными вирусами.
Серол, идентификацию нередко осуществляют в два этапа. Сначала вирус изучают в реакции связывания комплемента (см.), или, если он обладает гемагглютинирующей активностью, в реакции торможения гемагглютинации (см.), а затем с помощью реакции нейтрализации. РСК в отношении многих вирусов не является строго специфичной. Так, аденовирусы человека и большинства животных имеют общий комплементсвязывающий антиген. Общий антиген имеют все известные реовирусы. В отношении других вирусов, напр, вирусов гриппа, РСК более специфична и позволяет определить их типовую принадлежность. То же самое относится к РТГА: она позволяет определить тип реовируса и очень специфична в отношении вирусов гриппа, но в то же время дает групповые реакции при идентификации тогавирусов.
Наиболее специфичной является реакция нейтрализации: в большинстве случаев она позволяет установить как видовую, так и типовую принадлежность вируса (для видов, подразделяющихся на типы). Ее осуществляют различными способами. Чаще всего готовят смесь вируса с сывороткой, к-рую затем испытывают тем или иным способом на наличие ненейтрализованного вируса.
Значительно реже И. в. проводят путем перекрестного испытания иммунитета: животных иммунизируют неизвестным вирусом, а затем заражают известным или наоборот.
Весьма широко для И. в. используют иммунофлюоресценцию (см.). Чаще всего инфицированные неизвестным вирусом клеточные культуры исследуют с флюоресцирующим иммуноглобулином к известному вирусу. Реже исследуют т. о. материал от больных (мазки из глотки при гриппе, мозг больных подострым склерозирующим панэнцефалитом на коревой антиген, мозг погибших от бешенства).
Преципитацию в агаре используют для И. в. довольно редко. В материале из кожных поражений больных оспой этим методом можно обнаружить вирусный антиген.
Некоторые виды вирусов пе удается достаточно четко дифференцировать путем изучения их антигенной структуры. В таких случаях прибегают к дополнительным тестам — определяют патогенность для животных, размножение в различных клеточных культурах и др. Т. о., напр., идентифицируют вирусы оспенной группы. Возбудитель натуральной оспы не вызывает поражений на скарифицированной коже кролика и не размножается в культурах клеток при t° выше 38,5°. В то же время вирусы осповакцины и оспы коров вызывают изменения на коже кролика и размножаются при t° до 40°. Отличаются вирусы также по морфологии поражений на хорионаллантоисной оболочке куриного эмбриона.
Иногда возникает необходимость дифференциации вакцинных штаммов вирусов от «диких». Так, фиксированный вирус бешенства отличают от «уличного» по его неспособности вызывать формирование телец Бабеша — Негри в мозге зараженных мышеи и ряду других показателей, вакцинные штаммы вируса полиомиелита — по неспособности к репродукции при повышенной температуре.
Библиография: Гайдамович С. Я. Классификация и идентификация арбовирусов, Вестн. АМН СССР, № б, с. 25, 1972; Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний, под ред. Э. Леннета и Н. Шмидт, пер. с англ., М., 1974; Лурия С. и Дарнелл Дж. Общая вирусология, пер. с англ., М., 1970; Соколов М. И., С и н и ц к и й А. А. и P е-м e з о в П. И. Вирусологические и серологические исследования при вирусных инфекциях, Л., 1972.
Как вирусы обманывают человека?
Метафорическая зарисовка. Представители различных генетических вариантов SARS-CoV-2 собрались за круглым столом и обсуждают план захвата мира. Рисунок в полном размере.
Автор
Редакторы
Статья на конкурс «Био/Мол/Текст»: Вирусы умеют не только размножаться внутри клеток хозяина, но и прятаться от его иммунитета. Способов избежать фатальных встреч с оборонными силами организма существует множество, но один из самых хитрых (и потому особенно интересных) механизмов демонстрируют вирусы с измененными генетическими последовательностями. Эта статья расскажет, что такое генотипы и генетические варианты вирусов и почему так важно о них знать.
Конкурс «Био/Мол/Текст»-2020/2021
Эта работа опубликована в номинации «Вирусы и микроорганизмы» конкурса «Био/Мол/Текст»-2020/2021.
Генеральный партнер конкурса — ежегодная биотехнологическая конференция BiotechClub, организованная международной инновационной биотехнологической компанией BIOCAD.
Спонсор конкурса — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.
Спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.
Зачем нам знать о генетических вариантах вирусов?
Новости о коронавирусе на протяжении всего 2020 года оставались самыми читаемыми, а количество научных публикаций о SARS-CoV-2 почти в пять раз превысило число статей по другой «громкой» теме — системам CRISPR/Cas: по данным PubMed их уже больше 60 тысяч! И здесь важнее следить не столько за драматической статистикой заражений и исходов, сколько за потенциалом и способностями возбудителя. Ведь вирусы умеют мутировать и порождать таким образом новые генетические варианты [1].
Генетические варианты вируса — это геномы какого-то вида (или штамма) вируса, отличающиеся друг от друга по последовательности нуклеотидов, и эти отличия могут обусловливать появление новых штаммов. «Генотип», «субтип», «генетический вариант» — термины, отражающие степень геномных различий (в порядке убывания).
По мере накопления знаний по этой теме опасения ученых лишь крепли: мутации могут влиять как на вирулентность, так и на тяжесть протекания заболевания, развитие лекарственной устойчивости и вероятность повторного заражения [2].
У SARS-CoV-2 весной 2020 года выделяли 3 генотипа: A, B и C [1]. Но сейчас особое внимание обращают на некоторые генетические варианты этого вируса и их географическое распределение (рис. 1) [3]. Известно, что даже самое маленькое изменение в генетическом материале возбудителя способно сильно сказаться на протекании либо распространении заболевания. На что же могли повлиять мутации в геноме SARS-CoV-2?
Рисунок 1а. Схематическое изображение эволюции SARS-CoV-2
Рисунок 1б. Карта распространения генетических вариантов SARS-CoV-2
Например, единственная мутация в гене поверхностного белка (spike-белка), вызвавшая замену его 614-й аминокислоты — D614G, — способствовала распространению SARS-CoV-2 по миру [4], [5].
Другая мутация, C14408T, в последовательности, кодирующей вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp), потенциально способна влиять на развитие лекарственной устойчивости [6], [7]. Но самым поразительным можно считать случай, когда у пациента один генетический вариант SARS-CoV-2 заместился другим [8]. Дело в том, что наша иммунная система выстраивает защиту, по сути, от определенного вирусного генотипа. Если же вирус меняется, организм, встречавшийся с его предшествующим вариантом, новый может и не узнать.
Однако можно чуть-чуть успокоиться: мутации SARS-CoV-2 хоть и устроили хорошую суматоху, но так и не показали пока явной клинической значимости — в отличие от изменений ряда других вирусов. О них и пойдет речь дальше.
Вирусы гепатитов и компания
Гепатиты
В 2020 году Нобелевскую премию по физиологии или медицине вручили за открытие возбудителя одного из гепатитов — вируса гепатита С (ВГС, HCV) [9]. Болезнь может протекать без видимых симптомов, но при этом вирус сильно поражает печень. В крайних случаях развивается цирроз или даже рак печени [10]. К счастью, уже есть эффективные средства от гепатита С: по словам нобелевского лауреата Харви Олтера, противовирусные препараты прямого действия позволяют излечивать 95–98% пациентов [9]. Так в чем же подвох?
Интересно, что ВГС генотипов 1 и 4 обычно хуже поддаются терапии и требуют более продолжительного лечения, чем 2 и 3 [12].
| Генотипы ВГС | Субтипы |
|---|---|
| Генотип 1 | 1a, 1b |
| Генотип 2 | 2a, 2b, 2c, 2d |
| Генотип 3 | 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f |
| Генотип 4 | 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j |
| Генотип 5 | 5a |
| Генотип 6 | 6a |
| Генотип 7 |
При этом из-за высокой генетической вариативности, то есть больших различий между вирусными генотипами (до 30–35%), против ВГС не получается создать эффективную вакцину. Проблема усугубляется тем, что для тестирования прототипов вакцин нужны небольшие модельные животные, а получить мышей, способных одновременно болеть гепатитом С и имитировать человеческий иммунный ответ на инфекцию, очень трудно. И наконец, для изучения вируса in vitro нужно нарабатывать заразные частицы ВГС, а способные на это клеточные культуры появились лишь недавно [14].
Секвенирование вирусного генома показало, что в России циркулирует рекомбинантный вариант ВГС (RF2k/1b), генетически сходный с генотипами 1 и 2 одновременно. Из-за такой маскировки детекция этого генотипа затруднительна, а значит, и лечение бывает менее эффективным [15].
Итак, чтобы эффективно справиться с гепатитом С, нужно определить генотип его возбудителя. Не менее важно знать и генотип вируса, вызывающего другой гепатит — гепатит B. Да, от ВГВ (HBV) существует прививка [16]. Но! Есть основания считать, что генотипы ВГВ, несмотря на относительно небольшую вариативность (около 8% генома), по-разному влияют на тяжесть заболевания [17], [18].
Стоит, однако, учитывать, что результаты исследований связи вирусных генотипов с особенностями течения болезни весьма противоречивы. Чаще всего это связано с недостаточным размером изученных выборок, что, в свою очередь, обусловлено сложностями массового генотипирования. Из-за этого, например, на Тайване развитие гепатоцеллюлярной карциномы связывают с ВГВ генотипа В, а в Японии и КНР — с ВГВ генотипа С [19]. Тем не менее некоторые авторы приходят к выводу, что генотип ВГВ вообще не имеет большого клинического значения [20].
Хоть пока и нет общих рекомендаций проводить генотипирование ВГВ, ряд ученых призывает сделать его обязательным, поскольку пангенотипной терапии в случае гепатита В не разработано, а эффективность лекарств порой разнится в зависимости от генотипа.
Детекция генотипа вируса может стать хорошим подспорьем для врачей как минимум в двух направлениях: в определении вероятности развития той или иной формы болезни у конкретного пациента и в персонализации лечения. Однако подобных исследований крайне мало, можно даже сказать, что это поле еще совсем не пахано.
Денге
Мы уже заметили, что при разработке вакцин необходимо знать и учитывать разнообразие генотипов вируса. В этом отношении яркими примерами могут служить подходы к производству вакцин от гриппа и менее распространенной болезни — лихорадки денге, о возбудителе которой мы сейчас и расскажем [21].
Рисунок 2. Географическое распределение эндемичных по вирусу денге районов в 2011 году
У вируса денге выделяют четыре серотипа, то есть четыре группы вирусов с общей антигенной структурой. Генотипов у этого возбудителя больше, соответственно, и отслеживать их сложнее. Увы, но знания серотипа порой недостаточно для качественной вакцинации. Например, низкую эффективность одной из проходивших клинические исследования вакцин против серотипа 2 можно объяснить большой вариативностью составляющих его генотипов [22].
Существует мнение, что если эффективность вакцин против денге в новых клинических исследованиях останется низкой, при создании вакцинных препаратов необходимо будет отталкиваться именно от результатов генотипирования [21]. Это нужно и для исключения возможного антителозависимого усиления инфекции в случае, если вакцина будет защищать не от всех серотипов/генотипов, с которыми может встретиться отдельный организм.
Примечание
Антителозависимое усиление инфекции (ADE, antibody-dependent enhancement) — феномен, при котором связывание вируса с cубоптимальными нейтрализующими или не нейтрализующими антителами способствует его проникновению в иммунные клетки с последующей репликацией в них. Из-за ADE непроверенные вакцины могут быть очень опасными: при встрече с инфекцией вместо обеспечения защиты некоторые из них способны утяжелять течение заболевания [23].
Подводя итог, можно сказать, что знание генотипов вирусов необходимо для отслеживания распространения заболеваний по миру, для их лечения, а также для получения эффективных вакцин. К сожалению, пока генотип-специфичная борьба с инфекциями сильно ограничивается в том числе и недостатком информации о вирусных штаммах.
Но как вообще появляется это штаммовое разнообразие?
Вирусная хитрость: механизмы изменения геномов
Вирусы способны изменять свои свойства внутри клеток хозяев и в результате становиться заразнее и опаснее. Впрочем, не стоит пугаться. Обычно вирусная эволюция протекает в сторону снижения летальности, поскольку вирусу, который не убивает своего носителя и почти не вызывает симптомов, намного проще распространиться в популяции. Хоть геномы вирусов и изменяются с довольно высокой частотой, на деле мутации чаще оказываются нейтральными, не влекущими заметных последствий для вируса и его хозяина. Очень немногие из них действительно вносят вклад в дальнейшую эволюцию [24].
В основе способности вирусов к изменениям лежат мутации и/или обмен генетическим материалом между разными вирусами, результаты которых закрепляются или не закрепляются давлением естественного отбора.
Мутация — это изменение последовательности нуклеотидов в определенном участке генома, нередко приводящее к изменениям структуры и/или функций организма или вируса. Мутации могут возникать из-за ошибок работы ферментов, создающих копии геномов, или под действием среды.
Когда одну и ту же клетку заражает два родственных вируса, могут образовываться гибридные вирусы, содержащие измененный по сравнению с родительскими формами генетический материал. Этот процесс называют рекомбинацией или реассортацией, если у вирусов сегментированный геном (в частицу он упаковывается отдельными сегментами типа мини-хромосом) [25].
Для справки
До введения термина «реассортация» в научный обиход рекомбинацией называли любой обмен генами, включая и те процессы, которые сейчас со знанием дела именуют реассортацией [25].
Реассортация очень напоминает появление детей у родителей: когда два разных вириона попадают в одну клетку и приступают к размножению, они могут обменяться частями геномов (рис. 3). В результате получится новая вариация (штамм) вируса, которая может значительно отличаться от своих предков [25]. Такие вирусы порой становятся неузнаваемыми для иммунной системы и распространяются, вызывая эпидемии и пандемии. Этот сценарий характерен, например, для вирусов гриппа. Некоторые исследователи винят в пандемии той же «испанки» именно вирусную реассортацию [26].
Рисунок 3. Реассортация вирусов, которая приводит к появлению штамма с измененным генетическим материалом
Благодаря мутациям и обмену генетическим материалом вирус может даже менять своего хозяина. Так SARS-CoV-1 от летучих мышей перешел в семейство виверровых (к мусангам и циветам), а затем и к людям. В начале 2000-х этот вирус вызвал эпидемию, охватившую 29 стран [28].
Новые генотипы могут возникать и в ходе лабораторных пассажей, когда вирусом последовательно заражают нескольких животных, выделяя из них новую чистую культуру возбудителя [29]. Такая процедура нужна, в частности, для тестирования противовирусных лекарств и вакцин.
Свойства вируса во время пассажей меняются ступенчато. В первых пассажах в основном обнаруживают вирионы, изменившие какой-то один генетический признак. Но с увеличением числа пассажей у подавляющего большинства вирусных частиц наблюдают изменение многих генетических признаков.
Кроме рекомбинации и мутаций, изменчивость вируса может быть обусловлена влиянием хозяина (host-controlled variation). Такие модификации не затрагивают генетический материал вируса и встречаются, например, у ДНК-содержащих бактериофагов, вирусов гриппа и Сендай. Клетка может влиять на характер синтезируемых в ней вирусных компонентов. Или в вирусную частицу могут попадать хозяйские белки и липиды. Поэтому при смене клетки-хозяина в структуре оболочки вириона меняются и антигены, с помощью которых организм узнает вирус.
Итак, образование новых вирусных генотипов — совершенно обычное явление, основанное на стандартных эволюционных процессах. Однако как нам эти генотипы детектировать?
Как выявляют генотипы вирусов?
Теперь, когда мы знаем, как возникают вирусные генотипы и как от генетического варианта возбудителя могут зависеть течение, распространение и лечение заболевания, перейдем к обсуждению лабораторных методов. Они позволяют нам определять, вирус какого генотипа вызвал болезнь у конкретного пациента. Рассмотрим методы детекции генотипов на примере вируса ВГС. В настоящее время лабораторные анализы, используемые в схемах диагностики и лечения гепатита C, представлены серологическими тестами для обнаружения антител к ВГС, молекулярными тестами для выявления и количественной оценки РНК ВГС, а также методами генотипирования возбудителя [30].
При первоначальной диагностике гепатита C учитывают симптоматику и уровни ферментов печени (особенно аланинаминотрансферазы, АЛТ) в крови. У пациентов с подозрением на гепатит C иммуноферментным анализом (EIA) [31] или хемилюминесцентным иммуноанализом (CIA) выявляют антитела к ВГС. В популяциях с низким риском инфицирования этим вирусом отрицательного результата EIA или CIA достаточно, чтобы исключить заражение гепатитом C. Но важно помнить, что у пациентов с ВИЧ или последней стадией почечной недостаточности серологические тесты на антитела к ВГС могут давать ложноотрицательные результаты. Если тест выявил антитела или допускается возможность ложноотрицательного результата, в организме пациента должны искать РНК самогό вируса.
Определение статуса инфекции ВГС, решение о лечении и мониторинг ответа на него зависят от трех важных факторов: обнаружения РНК вируса гепатита С, ее количества и вирусного генотипа. Для оценки всех этих параметров есть несколько коммерческих тест-систем. Они различаются по диапазону обнаружения, чувствительности, специфичности, стоимости и сложности использования.
Выявление РНК вируса гепатита С основано на принципе амплификации нуклеиновых кислот [32], причем применяют здесь комбинацию разновидностей полимеразной цепной реакции (ПЦР): качественную ПЦР, опосредованную транскрипцией амплификацию (ТМА) и количественную ПЦР в реальном времени.
Генотипирование ВГС необходимо для назначения оптимальной схемы лечения. Генотип этого вируса можно определить несколькими методами, нацеленными на гены вирусных белков (E1, NS4 и NS5) и на 5′-нетранслируемую область (5′-UTR) генома ВГС. Они включают простую ПЦР, гибридизацию с генотип-специфичными зондами и ПЦР в реальном времени. Однако для более точного определения вирусного генотипа следует прибегать к методам секвенирования нового поколения (NGS) [33].
Наш проект HaploSense
Как мы уже поняли, определять генотипы сложно, поскольку практически нет быстрых и доступных тестов. Наша команда студентов и аспирантов под названием Moscow 2020 решила изменить эту ситуацию.
На международном конкурсе iGEM в этом году мы представили проект детектора генотипов вируса гепатита С. В основе детекции лежит система CRISPR-Cas, с которой многие читатели уже знакомы [34], [35], а принцип работы напоминает популярные методы детекции SHERLOCK (Specific High sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing) и DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter) [35]. Но есть и важные отличия, о которых сейчас расскажем.
В своей тест-системе мы использовали самый маленький из открытых к этому моменту Cas-белков — CasX (или Cas12e) из Deltaproteobacteria: он состоит из 980 аминокислотных остатков по сравнению с 1300 у Cas9 [36]. Как и Cas13a с Cas12a, маленький CasX обладает коллатеральной нуклеазной активностью (может неспецифически резать нуклеотидные последовательности, с которыми встретится после связывания с мишенью): она позволяет разрезать олигонуклеотиды с флуоресцентными метками после прикрепления белка к геному вируса. Но ВГС — РНК-содержащий вирус, поэтому для связывания с ним CasX нужно провести дополнительную реакцию: с помощью обратной транскрипции получить комплементарную последовательность ДНК.
Итак, в нашей системе четыре основные стадии (рис. 4):
Пока наша тест-система предполагает определение только одного генетического варианта ВГС — рекомбинантного RF2k/1b, распространенного в России. В 2020 году доступ в лабораторию для нас был закрыт, поэтому систему предстоит еще собрать и протестировать. Если все лабораторные испытания пройдут успешно, мы планируем расширить специфичность системы на все генотипы вируса, не умножая при этом количество приборов.
Рисунок 4. Схема детекции генотипов ВГС с помощью HaploSense
Такая на первый взгляд сложная система позволит определять генотип возбудителя гепатита С быстрее, вне специально оборудованной лаборатории и с не меньшей точностью, чем ПЦР. Мы надеемся, что когда-нибудь такой подход поможет сделать тестирование массовым и доступным.
Подробнее о iGEM
В 2020 году команда студентов с биологического факультета МГУ представила свою разработку на самом престижном международном конкурсе по синтетической биологии — The International Genetically Engineered Machines competition (iGEM). С английского название переводится как «Международное соревнование генно-инженерных машин». Это соревнование учредили в 2003 году в Массачусетском технологическом институте (Бостон, США). Школьники, студенты и аспиранты со всего мира и с разным академическим бэкграундом, начиная от журналистов и экономистов и заканчивая айтишниками и биологами, собираются в команды, в течение года работают над актуальной задачей и представляют свои проекты на осенней, финальной конференции Giant Jamboree. Конкурс iGEM уникален тем, что формирует открытое сообщество людей, которые обмениваются друг с другом и миром своими наработками. Выгодно отличают конкурс также комплексность и разноплановость проектов: упор делается на применение инженерных принципов и подходов, использование методов моделирования, обсуждение и проработку проекта с потенциальными пользователями и экспертами из разных областей (науки, бизнеса, права, государственного управления и т.д.). Образовательная деятельность, популяризация наук, налаживание между учеными и обществом мостов с целью обсуждения актуальных проблем — все это тоже входит в задачи команды. В этом году из-за пандемии конкурс проходил онлайн. Ядро нашей команды составляли студенты биологического факультета МГУ, которые получили бесценный опыт и выиграли золотую медаль. Однако подробнее об iGEM мы поговорим с вами в следующий раз [39].
Работа в команде
В конце марта 2020 года команда Moscow 2019 собрала новый состав для участия в конкурсе iGEM (рис. 5). Тогда впервые встретились незнакомые друг другу люди с общим желанием — создать проект в области синтетической биологии, который мог бы что-то изменить в мире.
Идея нашего проекта появилась только спустя полтора месяца, в начале мая. iGEM предлагает полную тематическую свободу: можно делать хлеб из дрожжей на Марсе, очищать воду бактериями, синтезировать натуральную краску для волос или разрабатывать системы мониторинга заболеваний. На выбор темы для нашего проекта сильно повлиял руководитель команды, Алексей Константинович Шайтан. Его лаборатория использует в работе системы CRISPR-Cas, а на их основе можно создавать детекторы заболеваний. Пандемия COVID-19 только начиналась, но уже было ясно, что SARS-CoV-2 необходимо выявлять быстро, массово и с высокой точностью. Так мы и создали наш проект — с целью детектировать генотипы коронавируса.
Очень важное требование конкурса — актуальность разработки. Другими словами, важно было понять, что наш проект нужен людям и его будут использовать. Этим проекты iGEM сильно отличаются от рутинной работы научных лабораторий. Именно поэтому мы встречались с экспертами, писали письма главному эпидемиологу Министерства здравоохранения, Николаю Ивановичу Брико, размещали посты в социальных сетях. Обратная связь полностью изменила наш проект: HaploSense переориентировался на детекцию генотипов вируса гепатита С.
С другой стороны, важен был сам детектор — как он будет работать, выглядеть, сможем ли мы его вообще собрать. Здесь нам на помощь пришел спонсор, компания BIOCAD. Эксперты компании консультировали нас относительно идеи проекта и ее реализуемости в столь короткие сроки. Они рассказали нам, как готовить патенты и выводить продукт на рынок. А это далеко не простые процессы.
В результате мы проанализировали гору тематической литературы, смогли придумать целостную систему на основе технологий CRISPR-Cas, провели ее моделирование и биоинформатический анализ.
Надо сказать, что организаторы iGEM помогают командам на протяжении всего пути: устраивают семинары, знакомят со специалистами, создают удобные платформы. А особенно поддерживают взаимодействие между командами. Все полгода мы общались и встречались с мотивированными ребятами из Америки, Эстонии, Индии, Франции, Германии и России (в этом году в конкурсе участвовали две команды из нашей страны). После таких встреч мы понимали, что можем сделать хороший, качественный проект, даже будучи студентами.
Рисунок 5. Команда iGEM Moscow 2020
Пандемия, конечно, сыграла свою роль в работе нашей команды: мы работали дистанционно и встречались друг с другом офлайн всего четыре раза. По-настоящему сплоченными мы стали, когда приблизились конкурсные дедлайны. Мы уложились в срок благодаря слаженной работе команды. Одному человеку было бы невозможно справиться: кроме разработки идеи проекта, моделирования и проведения экспериментов нам предстояло сделать сайт с описанием проекта, два видео о команде и работе, заполнить форму безопасности, написать обзор по теме, да и это еще не все. Именно поэтому проект iGEM — прежде всего командная работа.
Итоги конкурса подводятся осенью, в начале ноября, на Giant Jamboree — огромной конференции, где команды, профессора, лекторы и судьи собираются, чтобы обсудить проекты, подметить их сильные и слабые стороны, сформировать новые коллаборации и просто хорошо провести время. Это финал iGEM: проекты уже подготовлены, критерии конкурса соблюдены. Казалось бы, можно выдохнуть… Но здесь же команды встречаются с судьями — исследователями, которые будут оценивать проекты и детально их рецензировать. Мы, конечно, тоже общались с судьями (в этом году онлайн): в воскресенье, в 17:00, нас спрашивали, почему мы использовали LAMP, сколько тест-полосок будем применять, ну и много чего другого. А после нашу команду ждала неделя, полная лекций по синтетической биологии и общения с коллегами со всего мира, а также викторины по синтетической биологии и церемония награждения. В итоге мы выиграли золотую медаль и создали хороший проект, который продолжим развивать и, надеемся, доведем до состояния полноценной тест-системы, подходящей для обычных поликлиник.
Мы советуем всем молодым исследователям принимать участие в iGEM. Этот конкурс стал для нас лучшим событием 2020 года. Создать проект с нуля возможно, нужно только желание!